灌流取脑

大鼠灌注固定取脑

准备物品：

37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤

1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。

2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。

3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。

4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。

5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。时,剪开右心耳,使血液排出。观察肝脏逐渐变为白色为止

6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。

7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。

8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。插入时动作要慢,针尖方向不要偏向右侧,以免刺入右心房,如果感到有阻力,则将针退后、调整方向重新进针,直到进入主动脉,灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置,灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米,然后用丝线扎紧。切勿将灌注针放在左心室内,这样由于主动脉瓣的关闭,灌注液很难进入主动脉,而是沿着心室的切口流出,致使灌注失败。另外,灌注针插入成功后,一定要用剪刀剪开右心耳而不是右心室,这是灌流液的出口。剪开心尖的位置一定要掌握好,不能偏右使灌注针插入右心室。

2、配4％多聚甲醛PBS缓冲液：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

加热至60～65℃固然融解的快，只需要15分钟左右，不过容易挥发，气味难闻，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置，就基本没有气味散发的问题。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！。如果不着急，可先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密

封放置2天，就能全溶。

3灌注时夹上腹主动脉只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml 以下即可。

4 灌注时注意排空输液管中的气泡不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。

5、处死大鼠后迅速取脑放置于4%多聚甲醛中固定也可以，但取脑组织时未经固定的脑组织非常软，即使是刚刚处死的大鼠，也难免会造成微小的人为损伤，可能会影响切片后的观察。而且未经灌注的脑组织血管内会残余大量红细胞，观察血管形态会不太理想。

6、开胸时不要伤到心脏，心脏穿刺最好用留置针,软,不宜穿通室间隔,见血即退针芯.插针部位是心尖部,方向向中线.

7、生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体. 8、多基甲醛固定成功的表现是SD鼠四肢抽搐. 9、常见的体表标志是前囟和外耳道.

10、去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉.

11、灌注先快后慢于1小时内灌注完，生理盐水和多聚甲醛一般事先0度预冷，这样效果更佳。为切片方便，固定时勿必要将动物拉直；

12、多聚甲醛英文名称 Paraformaldehyde。为白色结晶粉末，易燃，不溶于乙醇，微溶于冷水，溶于稀酸、稀碱。多聚甲醛可经吸入、食入、经皮吸收。对呼吸道有强烈刺激性，引起鼻炎、咽喉炎、肺炎和肺水肿。对呼吸道有致敏作用。眼直接接触可致灼伤。对皮肤有刺激性，引起皮肤红肿。遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧的危险。如果大量泄漏，用水打湿然后收容回收。使用时应注意佩带防尘口罩、安全防护眼镜、穿相应的防护服、戴防护手套。工作现场禁止吸烟、进食和饮水。工作后，淋浴更衣。注意个人清洁卫生。如果皮肤接触：脱去污染的衣着，用肥皂水及清水彻底冲洗。眼睛接触：立即提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗至少15分钟、就医。吸入：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道能畅。呼吸困难时给输氧。呼吸停止时，立即进行人工呼吸后就医。误服者给饮大量温水，催吐，就医。

做免疫组化用４％多聚甲醛灌注固定，western不用固定，用生理盐水灌注冲洗血液，取材后放入-70冰箱备用，做原位杂交用甲醛，根据不同的用途还有用冰丙酮固定的。做冰冻切片的话，通常要包括组织固定、取脑固定、蔗糖固定