mobio试剂盒提取土壤DNA的步骤(翻译)

UltraClean SoilDNA Isolation Kit Sample详细过程

全过程戴上手套

1、在2 ml Bead Solution Tubes 里加入0.25—1g 土样（注意：请参照提示和纠错指南确定

加入土壤的量）。

发生的反应：土样或废渣样本被装入到Bead Tube中。这是溶解过程的第一步。Bead Solution 是一种打散土壤颗粒的溶液并开始溶解腐殖酸。

2、轻微地漩涡混合。

发生的反应：混合样本和Bead Solution。

3、检查S1溶液，如果S1溶液有沉淀，使用前加热到60℃使沉淀溶解。

发生的反应：S1溶液中含有SDS。如果冷却了就会产生沉淀。加热到60℃会使SDS 溶解。S1溶液在温热的时候可以使用。

4、加入60 μl S1溶液，漩涡几次或简短地漩涡（3-4s）。

发生的反应：S1溶液含有SDS。这是一种帮助细胞溶解的洗涤剂。这种洗涤剂可以破坏脂肪酸和几种微生物细胞膜相关的脂类。

5、加入200μl IRS溶液（抑制剂去除的溶液）。只有当DNA要用于PCR时才进行此

步。

发生的反应：IRS是一种专门设计的用于沉淀腐殖酸和其他PCR抑制物的试剂。DNA 要用于PCR时需要进行此步沉淀。腐殖酸通常呈棕色。他们属于有机化合物的一个大组分，存在于大多数富含有机质的土壤中。

6、确保使用MO BIO Vortex Adapter tube holder 进行漩涡时bead tube 是水平放置

的。最大速度漩涡10min。（更少量的DNA剪切见可选择的溶解方法）

注意：如果使用可放置多于12支试管的24空位的Vortex Adapter，增加5—10min 的漩涡时间。

发生的反应：略，见使用说明。

7、将试管在10000 × g离心30s。注意：不能超过10000 × g 否则试管会坏。

发生的反应：此时细胞的残骸、土壤、珠子和腐殖酸等的微粒将结合成沉淀。DNA在液体状的上清液中。

8、将上清液转移到另一支干净的2 ml Collection Tube中。

注意：根据不同土壤类型0.25g 土壤将会有400—450μl 上清液。上清液中可能仍然包含一些土壤颗粒。

9、在Collection Tube 中加入250μl S2溶液漩涡5s。4℃静置5min。

发生的反应：S2溶液中含有一种蛋白质沉淀试剂。这一步对于移除可能降低DNA纯度和抑制后续DNA利用的污染蛋白十分重要。

10、10000 × g 离心1min。

11、为了避免聚集成团，将整个上清液转移到另一只干净的2 ml Collection Tube中。

发生的反应：此时的沉淀物包含了腐殖酸、细胞残骸和蛋白质的残渣。为了获得最大量和质量最高的DNA，尽量避免将任何的团状物（颗粒）转移到试管中。

12、使用前摇晃S3溶液，加1.3 ml S3溶液到上清液中漩涡5s。

注意：大量的溶液将会漫到试管边缘，手拿试管时要小心。

发生的反应：S3溶液是一种使NA凝结的盐溶液。DNA在高盐浓度中凝结在硅砂上

13、将700μl 上步的溶液转入Spin Filter 10000 × g 离心1min。

14、弃掉流出液将剩下的上清液加入Spin Filter，10000 × g 离心1min。重复此步

知道所有的上清液都通过Spin Filter。

注意：每个样本需要三次添加过程。

发生的反应：DNA选择性地结合在spin filter的硅膜上。几乎所有污染物都通过了过滤膜，只留下需要的DNA。

15、加入300μl S4溶液10000 × g 离心30s。

发生的反应：S4是一种用于进一步清洁附着在spin filter 硅膜上DNA的清洗溶液。这种洗涤剂移除了使DNA粘附在硅膜上的盐、腐殖酸和其他污染物的残渣。

注意：如果需要可以进行一次以上的进一步DNA清洗。在土壤中含有很高的腐殖酸成分时，重复清洗的步骤很有益。

16、弃掉2 ml Collection Tube中的上层洗涤流出液。

发生的反应：洗涤流出液只是包含了乙醇洗涤溶液和没有粘附到spin filter 膜上的成分的废物。

17、10000 × g 离心1min。

发生的反应：此步移除掉S4溶液。移除所有的洗涤溶液是十分必要的，因为洗涤液将会影响DNA的下游反应。

18、小心地将Spin Filter放入新的干净的2 ml Collection Tube中。避免S4溶液溅到Spin

Filter中。

19、加入500μl S5溶液到白色滤膜的中央。

20、10000 × g 离心 30s。

发生的反应：当S5溶液（洗脱缓冲液）通过硅膜时，DNA脱离下来流经滤膜进入collection tube中。

21、弃掉Spin Filter。试管中的DNA可用于PCR了。

建议DNA冷冻在-80℃—-20℃中。