实验室土壤DNA提取方法

改良CTAB-SDS法

1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA；

0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。），在漩涡震荡仪上混匀。

2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。

3、加入20％ SDS缓冲液溶液100µl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min，取上清。

4、剩余残渣中再加500µl DNA提取液和100µl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。

5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。

6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。

7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30µl ddH

2

O溶解。

8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。

提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测

对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光

密度值。以OD

260/OD

280

（DNA/蛋白质），OD

260

/OD

230

（DNA/腐植酸）比值检测DNA纯

度。

DNA浓度=OD

260

值×50µg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]

试剂的配置：

1、0.1 mol/L Tris-Hcl

Tris（三羟甲基氨基甲烷），Mr = 121.14，称取12.114g Tris溶解900ml的蒸馏水中，加水定容至1000ml。

Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L）

50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100毫升。

pH (25℃) X (mL)

7.10 45.7

7.20 44.7

7.30 43.4

7.40 42.0

7.50 40.3

7.60 38.5

7.70 36.6

7.80 34.5

7.90 32.0

8.00 29.2

8.10 26.2

8.20 22.9

8.30 19.9

8.40 17.2

分别配置0.1Mol/L的Tris和0.1Mol/L的Hcl溶液，然后用pH计调到7.5。？？？？？

3 M 醋酸钠

□组份浓度3 M 醋酸钠（pH5.2）

□配制量100mL

□配置方法1. 称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。

2.加入冰乙酸调节pH值至5.2。

3. 3. 加入去离子水将溶液定容至100mL。

4. 4. 高温高压灭菌后，室温保存。

苯酚/氯仿/异戊醇

□配置方法

1.说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯/酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白（25 ：24 ：1）质变性并有助于液相与有机相的分离，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。

2.2. 配置方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24：1）均匀混合后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。