固定化青霉素酰化酶

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戊二醛交联壳聚糖固定化青霉素G酰化酶及其性质研究

活６／）４ＵｍＬ华东理工大学鲁华生物技术研究所
惠赠；其余试剂均为分析纯．７０２０型分光光度计，上海精密科学仪器公司；
ＳＢ一Ⅲ循环水式多用真空泵，Ｈ郑州长城科工贸公司；ＨＣ水浴恒温振荡器，ＳＡ— 金坛市恒丰仪器厂．
酰化酶显得尤为重要．双功能试剂戊二醛的醛基
将壳聚糖用去离子水浸泡洗涤，并且轻轻搅拌，混匀后静置２ｈ后抽滤．理后壳聚糖在不待处同浓度的戊二醛溶液中反应２４ｈ后，滤，ｐ抽用Ｈ

０１ｇ交联后壳聚糖置于不同ｐ盐浓度的．Ｈ、缓冲体系中，入一定量的酶液．其轻轻混匀加将后，在一定温度下反应一定时间．固定化后的酶经
２１２加酶量对固定化的影响固定化酶的活力．．先随着加酶量的增多而升高，酶量为１０Ｕ时达最６大；酶量继续加大反而固定化效果不理想（加图
７５的缓冲液淋洗３次．．
作者简介：仕伟（９６）男，东潍坊人，士，师，究方向：工程程１７一，山博讲研酶
１４６
烟台大学学报（自然科学与工程版）造成酶与载体结合的能力降低．
第２４卷
程仕伟，贾彦荣，缪静，慧鸽屈
（东大学生命科学学院，鲁山东烟台２４２）６０５
摘要：以戊二醛为交联剂，壳聚糖为载体固定化粪产碱杆菌来源的青霉素Ｇ酰化酶．通过

功能化介孔分子筛用于固定化青霉素酰化酶

ＮＣＭＣｎ－ＣＦｗｅｅｈｇｅｈｎｔａｎｔｅｈｄｏｈｌＭＣＦａｄＭＣＦ．Ｔｈｐａｅｔａｔｖｔｆ — ＦａｄＨＳＭｒｉｈｒｔａｈｔｏｈｙｒｐｉｃＨ２ｉＮ— ｎｅａｐｒｎｃｉｉｙｏ
ｗｅｅｃｍｐａａｉｌｔｄｉｄ．ＴｈｅｒｓｌｓｉｉａｅｈａｈｅＰＧＡｏｄｉａｅｏｈｅｈｒｏｒｔｖｅｙｓｕｅｅｕｔｎｄｃｔｄｔｔｔｌａｎｇｒｔｎｔｙｄｒｐｈｏｃＣＨ２一ＣＨ — ＣＦ，ｏｂｉＭ
（ｙＬｂｒｔｒｆＥｅｇｏｒｅｎｈｍｉｌＥｇｎｅｉｇ，ＮｉｇｉＵｉｅｓｔＫｅａｏａｏｙｏｎｒｙＳｕｃｓｄＣｅｃｎｉｅｒｎａａｎｘａｎｖｒｉｙ，Ｙｎｈａ５０１ｈｎ）ｉｃｕｎ７０２，Ｃｉａ
Ｎ — ＦＣＭＣ、Ｃ一ＣＨＭＣ和ＨＳＭＣＨ — Ｆ — Ｆ对ＰＡ的负载速率高于具有亲水性的Ｈｚ — Ｆ和ＭＣ；固定化酶ＧＮＭＣＦＰＡ／ＣＭＣ和Ｐ／ＧＮ－ＦＧＡＣＨ２ＣＭＣ的表观活性分别为１９Ｕ／一Ｈ— Ｆ７０Ｉｇ和１６Ｕ／，明显高于Ｐ６７ＩｇＧＡ／ＦＭＣ。关键词：孔材料；功能化；青霉素酰化酶；固定化介
Ａｂｔａｔｓｒｃ：ＯｒａｉｆｎｔｎｌｅｓｐｒｕｔｒａＭＣＦｗｉｉｙ一ＣＨ — ＣＨｚ，ｃａｏ（ＣＮ）ｍｉｏｇｎｃｕｃｉａｉｄｍｅｏｏｏｓｍａｅｉｌＲ— ｏｚｔｖｎｌ（ｈ）ｙｎ一，ａｎ

固定化青霉素酰化酶在双水相体系中催化合成氨苄西林

摘
要：通过研究氨苄西林、一基青霉烷酸（－Ａ）Ｄ＿甘氨酸甲酯（－Ｇ６氨６ＡＰ和苯ＤＰＭＥ在聚乙二醇（Ｅ和不同盐）ＰＧ）
组成的双水相体系（ＴＰ）的分配行为，立了一个由ＰＧ－００一２）硫酸铵（一１）成的双水相ＡＳ中建Ｅ４０（０和５组
风海德尔公司）聚乙二醇一０ＰＧ４０Ｍｒ，４０（Ｅ一０，一
３０６，海浦东高南化工厂，析纯）聚乙二７￣４０上分，
醇～００ＰＧ－００Ｍ０～４５０上海浦东高４０（Ｅ４０，一３５００，南化工厂，析纯）正硅酸乙酯（分，上海化学试剂公
体系．此体系中，苄西林的分配系数为５０６ＡＰ和Ｄ— 在氨．，－ＡＰＧＭＥ的分配系数分别为ｌ７和１４＿．．以环氧基功能
化介孔分子筛ＳＡ１Ｂ一５为载体固定青霉素酰化酶（ｅｉｌｎＧＡｙａｅＰＡ）并在双水相体系中催化合成氨苄西Ｐｎｃｌｃｌｓ，Ｇ，ｉｉ林，率为８，过４次的连续合成，率提高到９，产Ｏ经批产８而在水相体系中酶促合成氨苄西林的产率仅为２．７
２０Ｐ２０Ｃ型ｘ射线粉末衍射仪，国Ｍｉｏｒｉ美ｃｍｅｉｃｒｔｓ
纯度为９，ｒＡｅａ８ＡＩｓｒ公司）青霉素酰化酶ａ，

青霉素酰化酶固定化工艺浅析

回收率＝固定化酶活总量，结合酶活总量：
酶固定在一些坚固耐磨的载体．能够反复多次使用，减少酶的用量和酶对下游产品的污染．节约分离费用．减少对刺激性化学品的需求，在温和、无环境污染的条件下完成化工医药生产．从而实现绿色化学，有助于保护环境。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易与反应体系分离、可多次反复使用、成本低廉等优点．可以有效防止对产物的蛋白污染和微生物污染等。具有非常广阔的发展前途。
时间为２４ｈ～２８ｈ表２固定化时间对固定化酶活及回收率的影响
时间
ｈ
２０２４
２８
产品的性能、质量及成本等有直接影响的工序，固定化效果的好坏直接影响了产品收率及酶的使用效果。固定化酶应用
序号残余酶液结合酶活固定化酶活
酶活Ｉｌ／ｒｎｌ总量Ｍｕ
１３．８２０８．３４
主要研究内容生物工程酶是一种可使生物降解的蛋白质，
它可以提高生产效率、降低成本并生产出更优质的产品。青霉素酰化酶可用于制备半合成青霉素的关键中间体６一氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ），青霉素Ｇ钾盐在青霉素酰化酶的作用下

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展

（ＳｔｔｙＬａ１ａｅＫｅｂｏｒｏｒａｅｉｌ— ｉｎｔｄＣｈｅｉａｇｉｅｉｇ，ＣｏｌｅｆＬｉｅＳｃｅｅａｎａｔｙｏｆＭｔｒａｓＯｒｅｅｍｃｌＥｎｎｅｒｎｌｇｅｏｆｉｎｃｄ
Ｐｈｒｃｕｉａｇｎｅｉｇ．ＮａｊｇＵｎｖｒｉｙｏｃｎｌｇＮａｊｇ２０９ａｍａｅｔｌｃＥｎｉｅｒｎｎｉｉｅｓｔｆＴｅｈｏｏｙ，ｎｎｉ１０；ｎ０
摘要：青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、性药物的拆分和多肽合成等方面。效固定青霉素酰化手高酶能提高酶对温度、Ｈ值、剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和ｐ溶将关键。文主要介绍了青霉索酰化酶固定化技术的进展，论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，本讨并
２ＳｔｅＫｅｂａｔｒａｅｉｌ — ｉｎｔｄＣｈｅｉａｌＥｎｎｅｒｎａｔｙＬａｏｒｏｙｏｆＭｔｒａｓＯｒｅｅｍｃｇｉｅｉｇ，ＣｏｌｅｅｏｆＭａｅｉｌｃｅｅｌｇｔｒａＳｉｎｃ
ａｄＥｎｉｅｒｎｎｇｎｅｉｇ，ＮａｊｇＵｎｖｒｉｆＴｅｈｏｏｙ，Ｎａｊｎ１０９ｎｉｉｅｓｔｏｃｎｌｇｎｙｎｉｇ２００）

酶固定化实验报告

一、实验目的1. 了解酶固定化的原理和方法。

2. 掌握酶固定化过程中的关键步骤。

3. 分析固定化酶的性能及其影响因素。

二、实验原理酶固定化是将酶固定在固体载体上，使其在反应过程中保持活性，便于重复使用。

固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长酶的使用寿命。

2. 降低酶的生产成本，提高生产效率。

3. 方便酶的分离和回收，减少环境污染。

三、实验材料1. 酶：青霉素酰化酶（PGA）2. 固定化载体：海藻酸钠、明胶、壳聚糖等3. 试剂：NaCl、CaCl2、HCl、NaOH、磷酸盐缓冲液等4. 仪器：恒温水浴、pH计、分光光度计、移液器、离心机等四、实验步骤1. 酶的活化将青霉素酰化酶溶于磷酸盐缓冲液，调节pH值为7.0，在37℃下活化30分钟。

2. 载体的准备将海藻酸钠、明胶、壳聚糖等载体分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为1%的溶液。

3. 酶的固定化将活化后的酶与载体溶液混合，搅拌混合均匀。

将混合液滴入CaCl2溶液中，使酶与载体形成凝胶珠。

4. 固定化酶的洗涤用磷酸盐缓冲液反复洗涤固定化酶凝胶珠，去除未固定的酶和杂质。

5. 固定化酶的活化将洗涤后的固定化酶凝胶珠放入磷酸盐缓冲液中，在37℃下活化30分钟。

6. 酶活性的测定采用比色法测定固定化酶的活性。

以青霉素G为底物，在37℃下反应30分钟，用紫外分光光度计测定反应液中的青霉素G浓度，计算酶活性。

7. 固定化酶的稳定性测试将固定化酶凝胶珠分别在不同温度、pH值、离子强度等条件下进行稳定性测试。

五、实验结果与分析1. 酶的固定化效果通过比色法测定，固定化酶的活性与游离酶活性相近，表明固定化过程未对酶活性产生显著影响。

2. 固定化酶的稳定性固定化酶在不同温度、pH值、离子强度等条件下均表现出良好的稳定性，表明固定化酶具有良好的耐温、耐酸碱、耐盐等性能。

3. 固定化酶的重复使用性固定化酶经过多次反应和洗涤后，仍保持较高的酶活性，表明固定化酶具有良好的重复使用性。

青霉素酰化酶的固定技术分析

青霉素酰化酶的固定技术分析作者：高磊来源：《中国科技博览》2014年第11期论文摘要：文章讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。

一、青霉素酰化酶的固定化方法固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。

载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种。

1 、载体固定法吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。

物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。

离子吸附是利用酶解离状态2、无载体固定法（1）交联酶晶体（CLECs）晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限，浓缩的蛋白形成晶体，通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联，分子中静电反应和疏水反应数量增加，明显增强了蛋白质的稳定性。

交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域，应用前景广泛。

（2）交联酶聚集体（CLEAs） CLEAs的活性和稳定性可与CLECs相媲美。

在CLEAs制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出，能保持酶的三维构象和活性。

再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成CLEAs。

CLEAs催化的高效转化率和高效可循环再利用的特点，有利于实现固定化青霉素酰化酶的工业应用价值。

二、不同菌属青霉素酰化酶的固定化条件不同菌属所产青霉素酰化酶可能对应不同的固定化条件。

大规模生产青霉素G酰化酶的菌种有巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、埃希菌属大肠埃希菌（Escherichia coli）、雷氏普罗威登菌（Providencia rettgeri）和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）等，尤以前两种最常见。

产青霉素V酰化酶的菌种多为淡紫链霉菌（Streptomyces lavendulae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、球形杆菌（Bacillus sphaericus）和气单胞菌属（Aeromonas）等。

青霉素G酰化酶的改造和固定化研究的开题报告

青霉素G酰化酶的改造和固定化研究的开题报告一、选题背景及意义青霉素G是一种具有广谱抗菌活性的β内酰胺类抗生素，在医学和兽药领域被广泛应用。

但是，青霉素酰基水解酶的存在限制了其使用范围和药效，因此寻找革新青霉素酰化技术的方法显得尤为重要。

而酰化酶的改造和固定化则成为了当前较为研究的方向与方法。

二、研究目的本研究的目的在于通过改造青霉素G酰化酶的活性位点，构建出具有高活性和产率的工程菌，并通过固定化技术，提高酰化酶的稳定性与重复使用性，从而实现合成高纯度、高质量的青霉素G。

三、研究内容和方法1.青霉素G酰化酶的建模与分析。

利用生物信息学和分子模拟等方法，根据已知的结构信息和功能位点，建立青霉素G酰化酶的三维结构模型，分析酶的结构特征和作用机制。

2.酶的改造与筛选。

利用线性和平面的改造方法改变酶的活性位点，经过筛选与优化，得到具有高活性和稳定性的新型青霉素G酰化酶。

3.青霉素G的合成实验。

选取酰化酶的最佳条件，苯丙酸（或其酯）和青霉素G为底物，通过化学合成制备合成前体，最终通过提纯得到高纯度、高质量的青霉素G。

4.酶的固定化实验。

通过将酰化酶固定在载体上，如Nylon 6和聚乙烯醇（PVA）等，使其具有更好的稳定性和重复利用性。

并在不同的操作条件下，比较固定化酶和游离酶的酰化效率、产率和稳定性差异。

四、研究预期结果1.成功建立青霉素G酰化酶的三维结构模型，分析了其结构和功能特点。

2.通过改造酶的活性位点，筛选出具有高活性和高稳定性的酯化酶，并合成了高纯度、高质量的青霉素G。

3.通过固定化实验，得到具有更高稳定性和重复利用性的酰化酶。

五、研究进度安排1.前期准备和文献调研：一周。

2.酶的结构建模与分析：两周。

3.酶的改造和筛选：三周。

4.青霉素G的合成实验：三周。

5.酶的固定化实验：两周。

6.结果分析和论文撰写：两周。

7.答辩准备和论文修改：一周。

总计实践时间：14周。

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展在如今医疗体系发展的过程中，青霉素酰化酶已经被广泛的使用到了抗生素制备体系中，以及一些多肽合成体系中。

高效的青霉素酰化酶使用，能够最大限度的提升酶本身在PH值、溶剂极性、温度等各个方面适用效果大幅度提高，这实际上已经成为了青霉素酰化酶在如今工业体系中应用的关键。

本篇文章着重针对青霉素酰化酶的固定化以及应用进展进行了全面详细的探讨。

标签：青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用青霉素酰化酶本身在实际使用的过程中，呈现出了良好的溶剂记性使用想以及反复使用的多方面稳定效果，由于这一特性的存在，使得青霉素酰化酶已经成为了工业体系的关键梭子啊。

下文主要是从载体选择固化以及应用的进展上来进行了全面详细的探讨。

1、载体形式1. 1有机高分子载体有机载体本身在实际使用的过程中，实际上具备了极为优秀的机械性强度，同时也完全可以通过产业化形式进行生产，天然性质的高分子载体在实际运行的过程过程中，表现出了极为优秀的传质性能、无毒性，被广泛使用到了壳聚糖、甲壳素之中。

由于其本身呈现出的有机分子有着较高的强度，但是在传质性能较差的情况下，例如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等一列的物质。

而从相关的研究结果来看，在针对高密度环氧结构体系下的载体固定，使用青霉素酰化酶执行了相应的处理之后又，催化活力所表现出的相关游离酶在这一过程中大幅度的提高，并且呈现出的重复使用稳定性也极强。

1.2无机分子载体在如今材料学持续发展的过程中，已经涌现出了孔分子筛形式的载体，其本身能够有效的对于高稳定的固化酶进行制备处理。

在使用了无机载体执行表面修饰以及酶固定的相关措施之后，其本身所表现出的相关性能实际上必然能够有较大幅度的提升。

某小组在进行课题研究的过程中，曾直接使用表面氨基形式的介孔二氧化硅材料，来针对青霉素酰化酶加以固定处理，其中呈现出的活力实际上直接达到了90%及以上，特别是在循环使用10次的催化处理之后，其中所表现出的活力实际上依然是维持在94%的水平上。

青霉素酰化酶在新型复合载体上的固定化研究

・
２・０
山西
化
工
２１００年６月
过硫酸铵于四口烧瓶中，加人２０ｍ再５Ｌ蒸馏水，在
Ｎ的保护下搅拌，空气３ｉ，温至４：排０ｍｎ升５℃ ，在搅拌下进行接枝聚合反应。反应６ｈ后，抽滤，将所制得产物重复用大量蒸馏水冲洗，得复合载体制ＰＭ—ｉＡＳＯ。然后，放于鼓风干燥器中干燥保存。
力。本文通过接枝法制备复合载体ＰＭ．Ｏ，ＡＳｉ对其最佳固定化条件进行了研究，察了固定化考
酶的酶促反应最适宜ｐＨ值及温度，望为此种固期定化青霉素酰化酶的实际应用提供必要的理论
引言
青霉素酰化酶（Ａ）又称为青霉素酰胺酶或青Ｐ，
１实验部分
１１原料及仪器．
硅胶，６Ｉ～１０Ｉ青岛海洋化工有限公９ｚ．ｍ２ｚ，ｍ，司，剂级；氯丙基三甲氧基硅烷，京永超化工试，南有限公司，分析纯；丙烯酰胺，津复光化工有限公天
史
（．１中北大学化工与环境学院，山西太原
楠王福岭．
济南２００）５１１
００５；．东胜利股份有限公司生物产３部，３０１２山，ｋ山东
摘要：在反应温度为４５℃、反应时间为６ｈ丙烯酰胺（Ｍ）量浓度为４／、、Ａ质ｏｇＬ引发剂用量为单体质量１的条件下制得ＰＭ—ｉ复合载体，％ＡＳＯ利用红外光谱表征了其化学结构，热失重法测定其接

青霉素G酰化酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质

青霉素G酰化酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质屈冠群;曹雪荣;王雷;薛屏【摘要】利用凝胶-溶胶方法对磁性Fe3O4微粒表面进行功能化修饰,制备了表面含氨丙基的磁性复合载体,并通过戊二醛交联制备固定化青霉素G酰化酶(PGA).结果表明,在37℃时,固定化酶水解青霉素G钾盐,制备6-氨基青霉烷酸的表观活性为1 886 IU/g,表观米氏常数K'm＝140 mmol/L,最大反应速度Vmax＝0.45 mmol/min,水解反应最佳温度T＝50℃,最佳pH=7.0～8.0.固定化酶具有一定的热稳定性和耐酸碱性,在pH＝6.0～9.0且T＜50℃时活性稳定.固定化酶经10次间歇操作使用,可保持初始催化活性的82%.%The magnetic composite support with a saturation magnetization value of 27.2 A · m2 · kg-1 was prepared via the sol-gel.The amino groups existing on the magnetic composite carrier could couple penicillin G acylase (PGA) by cross-linking with glutaraldehyde to form the immobilized enzyme.The catalytic performances of the immobilized PGA for hydrolyzing penicillin G potassium to produce6aminopenicillanic acid were studied.The apparent activity of the immobilized PGA was 1886 IU/g.The optimal temperature and the optimal pH were 50 ℃ and 7.0～8.0 for the hydrolysis reaction, respectively.The apparent Michaelis constant K'm and Vmax of the immobilized PGA were 240 mmol/L and 0.45 mmol/min, respectively.It was found that the thermal stability and the durability on acidic or basic medium of PGA immobilized the magnetic composite support increased greatly compared with those of the free enzyme, and its activity keeps 82.0％ of its original activity afterused 10 cycles.The immobilized PGA can be sedimentated fleetly in magnetic field and separated facilely from the product in applications.【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)001【总页数】5页(P57-61)【关键词】磁性复合载体;固定化青霉素G酰化酶;催化活性;酶学性质【作者】屈冠群;曹雪荣;王雷;薛屏【作者单位】宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021;宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021;宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021;宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021【正文语种】中文【中图分类】O6436－氨基青霉烷酸（6－APA）是生产各种半合成青霉素的关键中间体.利用固定化青霉素G酰化酶（penicillin G acylase，PGA）催化水解青霉素G制备6－氨基青霉烷酸，反应条件温和，产率高，同时避免了毒性物质的使用，因而受到了广泛的关注［1—3］.然而，可溶性酶直接用于催化过程，酶与产物难以分离且不可重复使用，造成使用成本较高.因此，青霉素酰化酶的固定化技术一直是酶工业化应用领域研究的重要课题.无机载体用于青霉素酰化酶的固定化，其突出的优势是载体材料可以重复使用，不存在材料的后处理问题.近年来，介孔分子筛材料固定化青霉素酰化酶的研究受到了广泛重视［4—5］，该材料通过物理吸附制备的固定化酶再活性高，但操作稳定差，其原因是使用过程中酶分子出现脱落［6］.笔者用溶胶－凝胶方法将无定形SiO2包裹于Fe3O4纳米粒子表面，用3－氨丙基三乙氧基硅烷硅与SiO2硅羟基反应制得表面含氨丙基磁性复合载体，再利用戊二醛交联获得了共价键结合的固定化青霉素G酰化酶，并研究了氨丙基磁性复合载体对青霉素G酰化酶的固定化作用和固定酶的酶学性质.结果表明，磁性载体制备的固定化酶，在磁场的作用下能够快速从反应体系中分离、回收［7—8］，因而操作过程易实现自动化控制.1 实验1.1 试剂与仪器青霉素G酰化酶（PGA，1 062IU／mL，浙江顺风海德尔公司）；青霉素G钾盐（PGK，河北制药厂）；考马斯亮蓝（G－250，国药集团化学试剂有限公司）；3－氨基丙基三乙氧基硅烷（美国Acros公司，优级纯）；正硅酸乙酯（上海化学试剂厂，分析纯）；FeCl2·4H2O（上海化学试剂厂，分析纯）；FeCl3· 6H2O （天津瑞金特化学品有限公司，分析纯），其他试剂均为分析纯.D／Max－2200PC X－射线粉末衍射仪（日本RigaKu公司）；JSM－6360LV扫描电子显微镜（日本JEOL公司）；7304振动样品磁强计（美国Lake Shore公司）.1.2 氨丙基磁性复合载体的制备Fe3O4磁粉的制备采用共沉淀法.将0.43g FeCl2·4H2O和1.18g FeCl3·6H2O置于100mL的三口瓶中，加入20mL去离子水进行溶解.搅拌下滴入φ＝28%浓氨水至溶液的pH＝9，水浴加热至90℃熟化2h，磁场下分离出固体产物Fe3O4.Fe3O4用去离子水洗至淋洗液为中性，60℃真空干燥12h.取0.5g上述Fe3O4磁粉，装入盛有30mL无水乙醇的三颈烧瓶中进行超声处理，使Fe3O4在无水乙醇中得到充分分散；20min后滴入3.0mL浓氨水并在超声波中分散10min.然后将三颈烧瓶转移至40℃恒温水浴槽中，逐滴加入2.42mL正硅酸乙酯，此时体系中有溶胶形成；机械搅拌30min，加入0.28mL 3－氨基丙基三乙氧基硅烷，此时溶胶在60℃下熟化2h形成凝胶.磁场中分离出固体，用去离子水洗涤后于60℃真空干燥12h，得到氨丙基磁性复合载体，用NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4表示.1.3 固定化酶的制备和水解活性的测定取0.1g干态磁性复合载体，用去离子水润湿，加入4.60mL用pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液稀释的青霉素G酰化酶溶液和0.2mLφ＝25%的戊二醛，于30℃水浴摇床中振荡72h.磁场中分离出固定化酶，收集溶液，并用考马斯亮蓝染色法测定其中的酶蛋白量.固定化酶用pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液洗涤至用考马斯亮蓝G－250检测洗涤液中无蛋白质成分.固定化酶存于4℃冰箱中备用，用PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4表示.固定化酶装入25mL 37℃恒温的反应器中，加入2mL pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液和8mL去离子水，测定起始溶液的pH值.搅拌速度为150r／min下，将恒温37℃的10mL w＝4%的青霉素G钾盐水溶液移入反应器，pH计监测下用标准NaOH溶液滴定水解产生的苯乙酸，使反应体系的pH＝7.8.记录反应前10min所消耗NaOH溶液（c＝0.100 1mol／L）的体积，以每分钟催化青霉素G水解生成1μmol的6－APA所需的酶量定义为一个单位（IU）.固定化酶的表观活性AIME （IU／g）［9］为式中：cNaOH为NaOH的浓度（mol／L）；VNaOH为消耗NaOH的体积（mL）；m为载体干质量（g）；t为反应时间（min）.固定化酶的活力回收率RIME（%）：1.4 固定化酶操作稳定性考察用间歇操作方式考察固定化酶的操作稳定性，每次反应的底物均为0.400g.将0.200g NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4固定化酶装入37℃循环水加热的间歇式反应器中，加入pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液后，将37℃溶有0.400g青霉素G钾盐的水溶液加入反应器，滴入0.100 1mol／L的NaOH溶液，控制反应体系的pH＝7.8，直到反应液的pH值在1min内不再发生变化时终止反应.准确记录反应进行的时间和所消耗NaOH溶液的体积.每次反应后，固定化酶用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，再次装入反应器，重复使用10次.2 结果与讨论2.1 磁性复合载体的结构表征磁性复合载体NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的X－射线粉末衍射图（XRD）见图1.由图1可知，载体中Fe3O4粒子的结晶状态很好，其（311），（220），（400）和（440）等晶面衍射峰峰形尖锐，且各衍射峰的2θ与Fe3O4衍射峰的峰位相一致.图中2θ在20°～28°出现了宽化的衍射峰，这是无定形SiO2的衍射峰，说明NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4复合载体表面存在SiO2包层.制备过程中正硅酸乙酯和3－氨基丙基三乙氧基硅烷在Fe3O4粒子表面发生了水解和缩合反应，说明在Fe3O4粒子表面形成了SiO2包层的同时，氨丙基基团移植于磁性复合载体表面.图1 复合载体的XRD图扫描电子显微镜观察磁性复合载体NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的形貌见图2.由图2可知，载体是由粒径接近100nm的粒子组成，颗粒之间有团聚和粘连.磁性测定结果表明，制备的Fe3O4和NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4均具有超顺磁性能，即在外磁场存在下有磁性，外磁场撤除时磁性消失.制备的Fe3O4饱和磁化强度为66.2A·m2／kg，功能化NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的饱和磁强度为27.2A·m2／kg.NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的磁响应强度高于磁性聚合载体［10］，在外加磁场存在作用下，其能够被很好地磁化，制备的固定化酶极易从反应溶液中的分离.图2 NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的SEM照片NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4复合载体含有氨基，其可以与醛中的羰基发生亲核加成反应生成席夫碱（Schiff base）.戊二醛分子中含有两个醛基，它们分别与载体上的氨丙基和酶分子中的氨基发生Schiff反应，使酶分子与载体形成共价结合（图3），从而实现青霉素G酰化酶的固定化，固定化酶的活力回收率为42%.37℃下制备的固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4水解青霉素G钾盐的表观活性为1 866IU／g，呈现出高的催化活性.图3 NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4上戊二醛交联固定酶的示意图2.2 水解反应的最适pH值与温度酶的催化活性受反应体系pH值的影响很大，溶液的酸碱性可以改变酶活性中心有关基团的解离状态，同时还会影响底物的解离及反应体系中其他成份的解离，大大影响酶催化反应速度.固定反应温度为37℃，磁性固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4用于催化水解青霉素G钾制备6－氨基青霉烷酸（6－APA），以不同pH值的磷酸盐缓冲溶液配制w＝2%的底物溶液，绘制pH值与活性关系曲线（图4，图中数据取3次实验的平均值）.由图4可知，固定化酶的最适pH＝7.0～8.0，游离酶水解反应的最适pH＝8.0.与游离酶相比，固定化酶对反应体系的pH值变化不敏感，在较宽的pH值范围内均具有高的催化活性.固定pH＝7.8，固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4和游离酶PGA水解青霉素G的催化活性与反应温度之间的关系如图5所示.由图5可知，固定化酶和游离酶水解反应的最适温度不一致，前者为50℃，后者为45℃；同时，在低温（20～45℃）时，固定化酶活性下降幅度高于游离酶；在较高温度（50～55℃）时，固定化酶的活性比较稳定，而游离酶的活性迅速下降，在55℃反应时，前者保留最高活性的97.0%，而后者仅为51.6%.固定化酶在较高的反应温度下具有较好的催化活性，这有利于其工业化应用.图4 介质pH值对催化活性的影响图5 反应温度对催化活性的影响2.3 表观米氏常数与最大反应速度的测定以不同浓度的青霉素G钾盐溶液作底物，在37℃下测定固定化酶和游离酶对其水解的初速度的影响.以底物浓度的倒数为横坐标，反应初速度的倒数为纵坐标，做Lineweaver－Burk图［11］，研究PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的酶学行为（图6）.由图6数据可以计算出，游离酶的米氏常数Km＝8.2mmol／L，最大反应速度vmax＝1.02mmol／min，PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4固定化酶的表观米氏常数K′m＝240mmol／L，vmax＝0.47mmol／min.固定化酶的表观米氏常数高于游离酶，说明固定化酶对底物的亲和力小于游离酶，这可能是在固定化酶的周围形成了能与底物产生立体影响的扩散层所造成的.图6 固定化酶和游离酶的Lineweaver－Burk图2.4 固定化酶的稳定性固定化青霉素酰化酶用于水解青霉素G钾盐，除生成6－APA外，同时还有酸性较强的苯乙酸生成.工业上通过滴入一定浓度的碱溶液来控制反应体系的pH值，但在实际操作中，反应体系的pH值时常会出现过高或过低的现象，这就要求固定化酶对酸碱有一定的稳定性.将1mL原酶液和0.2g固定化青霉素酰化酶分别置于0.1mol／L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中，于30℃水浴中恒温24h.游离酶用0.1mol／L pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液调节溶液pH＝7.8，用碱滴定法测定37℃下水解2%青霉素G钾的活性.固定化酶先用pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液洗涤后再测活性（图7）.结果表明，PGA固定于NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4磁性载体，在pH值为6.0～9.0的介质中放置24h后，其表观活性保持在初始活性的90%以上，固定化酶对酸碱的稳定性优于游离酶.图7 固定化酶和游离酶对酸碱的稳定性将固定化酶和游离酶分别置于0.1mol／L pH＝7.8的磷酸缓冲溶液中，在不同温度保温2h后，测定它们的水解活性（图8）.由图8可知，PGA固定于NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4载体，热稳定性有显著的提高，在20～40℃经2h保温处理后，表观活性没有出现衰减，经45℃2h热处理后，活性有所下降，但下降幅度远小于游离酶，经60℃2h热处理后，固定酶仍保持其初始活性的66%；而游离酶的活性已基本丧失了.PGA经NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4固定化后热稳定性得到了大幅度的提高，可能是由于酶分子通过戊二醛与载体上氨丙基共价结合，增强了酶构型的牢固程度，当处于热处理环境时，酶蛋白分子的展开受到阻碍，导致酶活性中心的破坏大大减少.固定化酶的操作稳定性在很大程度上反映了固定化载体性能的优劣，它是决定固定化载体能否工业化应用最为关键的因素之一.采用碱滴定操作工艺考察固定化酶的操作稳定性，每次水解青霉素G钾盐为0.400g，结果见图9.图8 固定化酶和游离酶的热稳定性由图9可知，PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4经连续10次间歇操作使用，催化活性有所下降.经第5次重复使用后，活性下降幅度减小且趋于稳定，在第10次使用后，表观活性为初始活性的82.0%.图9 固定化酶的使用稳定性3 结论NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4磁性复合载体固定青霉素G酰化酶，酶与载体共价结合.固定化酶水解青霉素G钾盐制备6－氨基青霉烷酸的活性达1 886IU／g，且酶的热稳定性和耐酸碱性均得到明显的增强.固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4在磁场的作用下，能够快速有效地与产物分离，且在使用过程中不出现流失现象.参考文献：［1］ WANG Zhilong，WANG Li，XU Jianhe，et al.Enzymatic hydrolysis of penicillin G to 6－aminopenicillanic acid in cloud point system with discrete countercurrent experiment［J］.Enzyme and Micro Technol，2007，41（1／2）：121－126.［2］张业旺，谭强，刘瑞江，等.青霉素酰化酶制备6－APA的研究进展［J］.中国抗生素杂志，2008，33（7）：385－389.［3］周成，王安明，王华，等.青霉素酰化酶的固定化与应用新进展［J］.中国抗生素杂志，2008，33（5）：257－262.［4］LÜYongjun，GUO Yianglong，WANG Yanqin，et al.Immobilized penicillin G acylase on mesoporous silica：The influence of pore size，pore volume and mesophases［J］.Microporous Mesoporous Materials，2008，114（1／3）：507－510.［5］ XUE Ping，XU Fang，XU Lidong.Epoxy－functionalized mesostructured cellular Foams as effective support for covalent immobilization of penicillin G acylase［J］.Appl Surf Science，2008，255（5）：1625－1630.［6］薛屏.Co－MCM－48和Co－MCM－41介孔分子筛对青霉素酰化酶的固定化作用［J］.宁夏大学学报：自然科学版，2006，27（3）：243－247.［7］ NAGAO D，YOKOYAMA M，SAEKI S，et al.Pareparation of composite particles with magnetic silica core and fluorescent polymer shell ［J］.Colloid Polym Sci，2008，286（8／9）：959－964.［8］ SEN T，SEBASTIANELLI A，BRUCE J I.Mesoporous Silca－Magnetite nanocomposite：Fabrication and Applications in Magnetic Bioseparations ［J］.J Am Chem Soc，2006，128（22）：7130－7131.［9］ XUE 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固定化青霉素酰化酶合成阿莫西林活性测定

固定化青霉素酰化酶合成阿莫西林活性测定严正人;朱军;刘慧勤;魏士倩;张海燕;李红颖;刘丹【期刊名称】《医药工程设计》【年(卷),期】2015(000)001【摘要】The level of activity of immobilized penicillin acylase is the important factor which affects the speed of enzymatic synthesis of amoxicillin, thus it plays signiifcant role how to determine synthetic activity of immobilized penicillin acylase. Currently, the determination of activity of penicillin acylase is focus on hydrolytic activity of penicillin acylase. But there is lack of the reports on determination in activity of synthesis of amoxicillin, which leads to the fact that fast determination of the synthesis speed from penicillin acylase to amoxicillin may be impossible and the production cannot be guided from theory. In this article, the activity of amoxicillin synthesized from penicillin acylase was deifned and the method for measuring the activity was studied. It was shown that this method is easy to operate and the result is accurate and reliable. Moreover, by using this method the activities of penicillin acylases produced from different factories are easy to be compared so that the comparing results can be used as guidance for production.%固定化青霉素酰化酶的活性高低是影响酶催化合成阿莫西林速度的决定性因素，如何测定固定化青霉素酰化酶的合成活性起着至关重要的作用。

青霉素G酰化酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质

羟基反应制得表面含氨丙基磁性复合载体，利用再
戊二醛交联获得了共价键结合的固定化青霉素Ｇ酰化酶，并研究了氨丙基磁性复合载体对青霉素Ｇ
１２氨丙基磁性复合载体的制备．
Ｆ。４磁粉的制备采用共沉淀法．０４ｅＯ将．３ｇ
Ｔ＜５Ｏ℃ 时活性稳定．固定化酶经１０次间歇操作使用，可保持初始催化活性的８．２
关键词：性复合栽体；定化青霉素Ｇ酰化酶；化活性；学性质磁献标志码：Ａ
ＦＣ１ｅｚ・４Ｏ和１１ｅ。・６Ｏ置于１０ｍＬＨ．８ｇＦＣ１Ｈ０
酰化酶的固定化作用和固定酶的酶学性质．结果表
明，性载体制备的固定化酶，磁场的作用下能够磁在
的三口瓶中，入２去离子水进行溶解．拌下加ＯｍＬ搅
第３卷第１２期
Ｖｏ．２Ｎｏ１１３．
宁夏大学学报（自然科学版）
ＪｕｎｌｆＮｉｇｉＵｎｖｒｉ（ｔｒｌｃｅｃｉｏ）ｏｒａｏｎｘａｉｅｓｔＮａｕａＳｉｎｅＥｄｔｎｙｉ
２ｌ年３Ｏ１月
本ＪＯＬ公司）３４振动样品磁强计（国ＬｋＥ；７０美ａｅ
Ｓｏｅ公司）ｈｒ．
通过物理吸附制备的固定化酶再活性高，操作稳但

固定化青霉素酰化酶(PGA)生产7-ADCA技术

l 产品简介
7－ADCA 英文名称为 7－Amino－3－desacetoxyceph-alosporanic Acid, 产品为白色或微带黄色结晶性粉末。在水、乙醇或丙酮中不溶，在强酸或强碱溶液中溶解。分子式 C8H10N2O3S。
2 用途
7－ADCA 是一种重要的头孢类抗菌素半合成中间体，在医药合成中主要用于合成以下几种失孢菌素类药物：
我国的头孢菌素生产起步较晚，由于受中间体合成技术的限制，我国长期以来一直依靠进口 7－ADCA 或者进口原料药未满足国内市场需求，我国从“六五” 开始立项研制该产品，但因技术原因未能彬成工业化生产，仍然依赖进口。
在多年科研的基础上，1990 年代中期哈尔滨制药总厂投资建设了一条生产线，成为当时中国唯—一家具有 6－APA、7－ ACA、7-ADCA 三大抗生素母核生产能力的制药企业，现在该公司 7－AnA 生产能力已达到 22 t／a。浙江永宁制药厂也建设了一条 50 t／a 生产线。“七五”以来，为改变我国半合成抗生素依赖进口的局面，华药积极致力于半合成抗菌素的研究和产品升发。经过 10 年多的不懈努力，到 1999 年初开发出了加工半合成抗菌素的中间体 6－APA、7－ADCA 等，而且还研制开发出了半合成青霉类、半合成头孢菌素类多种半合成抗菌素原料药及制剂，华北制药信达有限公司于 1999 年 1 月 18 日全面投产，使华药的半合成抗生素总生产能力达到 1200t/a，成为我国目前最大、也是亚洲最大的半合成抗生素生产基地，其生产规模及技术水平都达到世界先进水平，现在华北制药集团的 7－ADCA 生产能力达到 225t/a。“九五”期间鲁抗集团投入技改、基建资金达 12.5 亿元，贯通了青霉素—→6-APA——→半合青——→制剂；青霉素 ——→7－ADCA－一→半合成头孢——→制剂及头孢菌素 C——→7－ACA——→ 头孢唑啉酸——→头孢唑啉钠（头孢哌酮）——→制剂等三条完整的生产链，1999 年底鲁抗医药 140 t／a 7－ ADCA 工程建成投产，成为国内 7－AnA 生产能力较大的厂家之一。

青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶[发明专利]

专利名称：青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶专利类型：发明专利
发明人：严惠敏,蒋建华,张蓓蕾
申请号：CN200410084489.1
申请日：20041124
公开号：CN1778909A
公开日：
20060531
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶，它们可分别由下列方法制备得到：将蛋白质浓度为8～12mg/ml、纯度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶纯化溶液，加入含有沉淀剂聚乙二醇、pH为6.0～7.0的缓冲溶液中进行结晶，其中聚乙二醇的重量占缓冲溶液体积的9～13％；将所述的青霉素酰化酶晶体加入含有双功能交联剂的缓冲系统中进行交联反应制得固定化青霉素酰化酶。

该固定化青霉素酰化酶具有对温度、酸碱、有机溶剂、蛋白酶不敏感，机械强度高，酶的含量及纯度高，使用方便，颗粒形状规则等特点。

申请人：上海医药工业研究院
地址：200040 上海市北京西路1320号
国籍：CN
代理机构：上海智信专利代理有限公司
代理人：薛琦
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