荠菜CBF冷诱导途径多价载体的构建和烟草转化

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蔊菜病毒诱导基因沉默体系构建

蔊菜病毒诱导基因沉默体系构建张怡;徐克东;杨松;李豪;曹鹏;魏森;韦丹丹;李成伟【摘要】Virus-induced gene silencing system of Rorippa indica Hiern was constructed ,which will be used in functional analysis of R.indicagenes.Cloroplasto alterados( CLA) gene fragments of cotton ,soybean and Arabidop-sis were obtained by using RT-PCR.The cloned CLA fragments were constructed into tobacco rattle virus vector (pYY13).The constructed vectors were transformed into Agrobacterium strain GV3101,which was used to inoculate R.indica plants.All the infected plants showed photobleaching symptom with different degrees .RT-PCR of target genes further confirmed the knock-down of CLA.The established VIGS system will contribute the further study of R. indica genes in the future research .%构建蔊菜的病毒诱导基因沉默（ Virus induced gene silencing ，VIGS）体系，旨在建立蔊菜的快速基因功能验证的方法。

通过RT-PCR扩增出棉花、大豆、拟南芥的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（Cloroplasto alterados，CLA）基因片段，并将其分别构建到烟草脆裂病毒（ Tobacco rattle virus ，TRV）介导的VIGS载体，通过农杆菌GV3101侵染蔊菜并观察蔊菜的表型变化。

两种化学诱导表达载体的构建及VGCfE：Gus在烟草中的瞬时表达分析

两种化学诱导表达载体的构建及VGCfE：Gus在烟草中的瞬时表达分析水稻是我国主要的粮食作物之一,为了有效稳定两系法杂交水稻制种过程中不育系在低温条件下的不育特性,本课题组拟以水稻育性相关基因OsUdt1作为调控靶基因,构建化学诱导植物干扰表达载体p3301VGCfE:Udt1i和报告基因表达载体p3301VGCfE:Gus,转化至相应的植物材料中,为进一步探讨化学诱导表达系统VGCfE在水稻育性转换中的调控作用奠定理论基础和实验依据。

本文完成了以下研究工作：1.化学诱导植物干扰表达载体p3301VGCfE:RNAi的构建本实验根据Genebank中水稻基因组七号染色体的序列,确定水稻Y58S中存在OsUdt1基因,并根据比对结果以及Genebank中提交的信息确定OsUdt1—3’UTR的序列,设计特异性引物,从水稻Y58S基因组DNA中扩增得到长约450bp的OsUdt1—3’UTR 的基因片段,经过Blast比对确定得到的片段与预期一致。

通过连接酶非依赖性克隆(LIC),分别将两段3’UTR以相反的方向连接到GA20oxidase第一个内含子的两端构建pUCC—Udt1i载体。

构建干扰片段后,因酶切位点受限,用RF克隆的方法将3’UTR—intron—3’UTR连接到已构建的载体p3301VGCfE上,经PCR检查确认植物干扰表达载体构建完成。

2.化学诱导植物表达报告基因载体p3301VGCfE:Gus的构建在合成载体pUC57—4635S后,通过与p1381z多克隆位点的比较,选择两个相同的酶切位点,对载体和片段进行酶切消化,酶切后在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段4635S 连接到载体p1381z上,通过PCR及测序检测确定目的片段连到载体上。

根据LIC 的原理设计特异性引物扩增46 35S—Gus片段,通过连接酶非依赖型克隆将目的片段连接到已构建的载体p3301VGCfE上,经PCR检查确认植物表达报告基因载体构建完成。

【挑战杯】超表达MfCOR1提高转基因烟草抗寒性和生物量

超表达MfCOR1提高转基因烟草抗寒性和生物量摘要：黄花苜蓿（Medicago falcalta）是一种非常耐寒的豆科牧草，是苜蓿抗性育种的重要基因库。

在本实验室已构建了黄花苜蓿响应低温的cDNA 消减文库基础上，从中选择一个cDNA片段克隆其cDNA全长605 bp，含有579 bp的开放阅读框，编码一个由192个氨基酸组成的蛋白。

在GenBank中尚无与该蛋白同源性高的序列，将编码该蛋白的基因暂命名为MfCOR1（Medicago falcalta cold responsive gene 1）。

该蛋白高度亲水，N-端含有叶绿体信号肽，推测其存在于叶绿体基质中。

利用半定量RT-PCR技术，分析了该基因在低温胁迫下的表达规律，在低温处理2-4 h时其表达已明显受到诱导，低温处理8-96 h后其表达量一直维持在高水平，初步证明MfCOR1是低温诱导基因。

构建了超表达载体pBI-MfCOR1，通过农杆菌介导法转化烟草获得了转基因植株，经过PCR检测筛选出51株阳性植株，挑选其中15株进行Southern杂交分析，结果表明这些转化植株来自不同的转化事件。

选择其中3个单位点的转基因植株T1代幼苗进行Southern杂交和RT-PCR检测，结果表明转基因能稳定遗传并且能表达。

进一步比较测定了低温胁迫对转基因植株T1代幼苗及其野生型对照的影响，转基因株系在冷、冻胁迫下相对电导率的升幅和在冷胁迫下净光合速率的降幅均低于野生型，表明显著提高了抗寒性，充分证明MfCOR1是一个耐寒1基因，与植物抗寒性密切相关。

转基因株系还表现为正常生长条件下苗期生物量显著增大，这与其具有更高的光合速率有关。

研究结果表明，MfCOR1是一个新的耐寒基因，可能参与叶绿体光合作用，提高植物的光合速率，促进苗期的生物量积累，是一个很有应用潜力的新基因，可应用于改良农作物的抗寒性和提高生物产量。

关键词：耐寒基因克隆转基因烟草抗寒性生物量Overexpression of MfCOR1 in Transgenic Tobacco Improves Cold Resistance and BiomassAbstract: Medicago falcata is a kind of Leguminosae forage grasses which has strong tolerance to cold stress. Because of its great resistance to cold, drought and leanness, Medicago falcate serve an important gene pool for crop resistance breeding. A SSH cDNA library of cold-responsive gene in Medicago falcata has been established in our laboratory, in which MfCOR1 gene has been shown to be cold-induced. The full length of MfCOR1 cDNA is 605 bp, which contains an open reading frame (ORF) of 579 bp and encodes a1peptide of 192 amino acids, but no obvious homological sequencehas been found in GenBank. The bioinformatics analysis indicats that the hydrophibic domain is dominant in the structure of MfCOR1 protein which has a predicted signal peptide of chloroplast and might be localized in stroma of chloroplast. The expression pattern of MfCOR1 was analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The expression of MfCOR1 is rapidly induced in response to low temperature, and sustained at high expression level up to 96 h after treatment. The over-expression vector of MfCOR1, pBI-MfCOR1, was constructed. The transgenic tobaccos were generated using Agrobacterium-mediated transformation. The transformant plants were analyzed using molecular determinations. PCR detection screens 51 positive MfCOR1 transgenic lines. 15 MfCOR1 transgenic plants were further analyzed by Southern blot. Southern blotting indicates that MfCOR1 integrate into the genome of tobacco from different transformed cases. Southern blot and RT-PCR analysis of 3 T1 plant lines indicates that MfCOR1 could inherite stably and express fully in the transgenic tobacco. Further investigation demonstrate that under lowtemperature stress the transgenic tobacco lines, compared with the1wild type, has a lower increase in comparatively conductance and decrease in net photosynthetic rate. The transgenic tobaccos showed stronger cold resistance than the wild type, and MfCOR1was full proved to be a cold tolerance gene. The results showed that MfCOR1 is closely related to plant cold resistance. Under optimum growth conditions, the transgenic tobaccos have a higher biomass than wild-type plants, as the result of the increase in the net photosynthetic rate in transgenic tobaccos. The results showed that MfCOR1is a novel cold tolerance gene; it may be concerned with photosynthesis, raise photosynthetic rate and biomass accumulation rate in seedling stage. In a word, MfCOR1 has great application potential in the aspect of improving cold resistance and production.Key words: cold tolerance gene cloning transgenic tobaccocold resistance biomass低温是制约植物生长、降低其产量的非生物因素之一。

抗冻基因CBF_2表达载体构建及转化紫花苜蓿的研究

摘要：研究以拟南芥基因组ＤＮＡ为模板．ＰＣＲ方法扩增目的基因，接到ＰＧＥＭ— Ｅｓｃｏ本用连ＴａｙＶｅｔｒ载体上构建
成克隆载体ＴＣＦ。用ＢｍＨＩ和Ｓｃ —Ｂａａ别对克隆载体ＴＣＦ１分Ｂ和植物表达载体ＰＩ２Ｂ１１进行双酶切，得目的获
株中，ｌＥ５值（导致５组织电解质渗漏出来的冰冻温度）０比末转化油菜低４６． ℃。
苜蓿（ｄｉａ ’ ｓｔｖ为温带地区重要的牧草，重要的饲料农作物，温是制约其生长的限制因子之一，Ｍｅｃｇａｉａ）０是低
第２Ｏ卷
第２期
草业学报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＩＴＵＲபைடு நூலகம் ＥＮＩＡＳ１Ｃ
ｌ９３— ２００
Ｖｏ．Ｏ。ｏ．１２Ｎ２
２１０１年４月
抗冻基因ＣＦＢ２表达载体构建及
转化紫花苜蓿的研究
刘晓静，凤，郝张德罡毛娟。于铁峰～，，
（农业大学草业学院，肃兰州７０７；．业生态系统教育部审点实验室巾一美草地畜牧、町持续发展ＬＨ肃甘３００２草Ｉ研究中心，ｆ肃兰州７０７；．｝肃农业大学农学院，肃兰州７０７）十３００３十３００

冷诱导调节元控制的(AFP)4基因植物表达载体pBCDG的构建

间５０ｐ６ｂ片段；琼脂糖凝胶（＝． ∞ １０％）电泳检测扩增片段，检测转化体。２．结果：号、一１、ｌ号菌落检测到．４２３５ｌ号８电泳扩增片段，冷冻保藏阳性菌落。３讨论．抗冻肽在动物细胞内可起抗冻作用，将抗冻肽注射入异种动物体内后仍有活力，并且活力与注射量成正比，这证明抗冻肽在行使抗冻功能时，不需要种属特异性的抗冻肽受体，因此可进行转
第１卷第６期６
呼伦贝尔学院学报
Ｎ６ｏ
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Ｖ１１ｏ．６
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２０年１０８２月
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厶４０：４４
收稿日期：２０－０１０７１－２
一简：立（９卜）ｒ汉呼尔院命学化学尊助譬，室：介杨霞１－族，伦贝学生科皇学，理实师实．８Ｊ，
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奉艳（９）１７一女，蒙古族，呼伦贝尔学院生命科学与化学学院，助理实验师，实验室教学。９张毅力（３），汉族，第二军医大学生理实验室，在读研究生，研究方向为分子生物学．１８一女９
后插入ＧＳＵ基因片段，对载体ｐＣＢＤ进行改进。载体ｐＣ中（Ｆ基因的终止密码子前ＢＤＡＰ）有一个Ｐｔ酶切位点，ｓ１终止密码子后有一个Ｋｎｐ１酶切位点；载体ｐＡ１ＧＳ因的前后分别Ｍ４２中Ｕ基有Ｐｔ和Ｋｎ的酶切位点。ｓｌｐｌ本文用Ｐｔ和Ｋｎｓｌｐ１双酶切载体质粒ｐＡ１和ｐＣ，Ｍ４２ＢＤ连接两个所需片段形成ＡＰＧＳＦ — Ｕ融合蛋白基因，构成的新载体称为ｐＣＧＢＤ。利用ＧＳ酶的瞬间表达量来检测Ｕ融合蛋白的存在，进而可用于研究ＡＰＦ在植物组织中的亚细胞定位和表达调控机制。将质粒ＤＣＧ转化农杆菌ＡｒａｔｉｕｅｃｎＢＤｇｏｃｒｍＴｍｆｉｓｂｅｕａｅＬＡ４４Ｂ４０，需要辅助质粒ｐｋ０３Ｒ１的辅助，载体２

AtICE1和AtCBF1～3基因表达载体的构建与转化烟草研究

AtICE1和AtCBF1～3基因表达载体的构建与转化烟草研究王冬梅;王明;李翠萍;苏承刚;张兴国;姚永宏【摘要】Cold-resistance in plants was determined by numerous genes. With transformation of the sole gene into plants, the Cold-resistance could be enhanced limitedly. Amplified from Arabidopsis thaliana genomic DNA and connected with Arabidopsis promoter 35 S, AtCBFl -3 and AtlCEl genes were used to construct the cold-induced plant expressing vectorpVCT2276. Thirty-five Kanamycin resistance plants were obtained by Agro-bacterium mediated genetic transformation. PCR results showed that 8 plants were positive. For later southern hybrid, 5 of positive plants were made strains.%植物抗寒属于复杂的数量性状.单一基因转化,植株抗寒性提高有限.本文利用拟南芥的AtCBF1～3和AtICE1 4个基因构建植物表达载体pVCT2276,通过农杆菌介导法转化烟草,获得35株抗性苗.经抗性筛选以及PCR鉴定,8株显示为阳性植株.将其中5株繁殖成株系,为后续的抗寒鉴定奠定基础.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2011(024)003【总页数】4页(P868-871)【关键词】抗寒；AtCBF1～3基因；AtICE1基因；转基因烟草【作者】王冬梅;王明;李翠萍;苏承刚;张兴国;姚永宏【作者单位】南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;重庆市农业科学院，重庆，401329【正文语种】中文【中图分类】Q78植物冷驯化机制一般有两种［1］:一种为冷诱导表达必须全部或部分借助ABA的低温诱导传递;另一种是纯粹的冷应答反应［1～2］，不依赖于ABA，表现为直接、快速的低温应答反应。

茶树冷胁迫诱导抗寒基因CBF的克隆与表达分析

茶叶科学 2009，29（1）：53~59Journal of Tea Science茶树冷胁迫诱导抗寒基因CBF的克隆与表达分析陈暄1,2，房婉萍2，邹中伟2，王玉花2，成浩1,2*，黎星辉2* （1. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江杭州 310008；2. 南京农业大学茶叶科学研究所，江苏南京 210095）摘要：利用cDNA-AFLP技术进行了茶树低温胁迫处理的基因表达差异分析，获得低温诱导后特异表达的差异片段TDF11（transcript derived fragment, TDF）。

经BLAST比对发现该片段与白菜、拟南芥、烟草的抗寒基因CBF（C-repeat binding factor）分别有94%、84%、81%的同源性。

通过3’/5’RACE的方法获得该片段cDNA 全长序列（GenBank，登录号EU857638）。

所得序列全长981bp，其开放阅读框编码275个氨基酸。

该基因与白菜、烟草、拟南芥中的CBF基因编码的氨基酸序列分别有74%、57%、57%的同源性。

用RT-PCR的方法对其在低温处理过程中的表达进行分析，结果表明，茶树CBF基因在低温诱导4 h开始表达，在8 h左右表达量最高，然后开始下降，但仍维持在一个较高的水平。

结果提示CBF基因可能在茶树抗寒分子机制的形成过程中发挥重要的作用。

关键词：茶树；CBF基因；克隆；表达分析中图分类号：S571.1；Q523 文献标识码：A 文章编号：1000-369X（2009）01-053-07Cloning and Expression Analysis of CBF Gene in Cold Induced Tea Plant [Camellia Sinensis (L.)O.Kuntze]CHEN Xuan1,2, FANG Wan-ping2, ZOU Zhong-wei2,WANG Yu-hua2, CHENG Hao1,2*, LI Xing-hui2(1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China;2. Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract: The cDNA-AFLP was applied to identify genes expressed differentially in cold acclimatized tea plant. A cDNA fragment, TDF11 encoding a CBF (C-repeat binding factor) protein was isolated and identified. The cDNA fragment had 94%、84%、81% homology with CBF genes from Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum by BLAST on NCBI. The complete cDNA sequence was cloned by RACE (rapid amplification of cDNA ends), named Camellia sinensis CBF gene. Its full cDNA sequence was 981bp (GenBank accession number EU857638) and contained an open reading frame encoding a polypeptide of 275 amino acid residues. Analysis of the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence showed 74%、57%、57% homology with CBF genes from Brassica napus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana. To identify differential expression of CBF gene, RT-PCR experiments were performed in six samples including leaves cold-induced for different treatments. The results showed that tea CBF gene expressed after cold induced for 4 hours and up to a maximum when cold induced for 8 h, and then decreased. It hinted the CBF gene might play a key role during the development of cold resistant molecular mechanism in tea plant.收稿日期：2008-09-26 修订日期：2008-10-30基金项目：教育部高校博士点基金（20060307024、20070307020）、江苏省科技攻关计划(BE2007301、BE2008320－2)、国家自然科学基金（30800884）、南京农业大学青年科技创新基金（KJ07008）、江苏省三项工程（sx2007g17、sx2008g10）、中国博士后科学基金（20070411061）、常州市科技攻关计划（CE2007210）资助。

AtICE1和AtCBF1~3基因表达载体的构建与转化烟草研究

ＳｔｉｓｏＶｅｔｒＣｏｓｒｃｉｎａｄＴｏｃｏｕｄｅｎｃｏｎｔｕｔｏｎｂａｃ
ＴｒｎｆｒａｉｎｗｉａｏｍｔｏｔＡ娃ＣＥｎＣＢＦｌ一３Ｃｌｓｅｎｓｓｈ１ａｄＡｔｕｔｒＧｅｅ
ＡｉＥｔ１和Ｃ几～Ｃ３基因表达载体的构建与转化烟草研究
王冬梅’王明，，李翠萍苏承刚，，张兴国ｈ，永宏姚
（．１南方山地园艺学教育部重点实验室．西南大学园艺园林学院，重庆４０１；．０７５２重庆市农业科学院，重庆４１２）０３９
ｃｕｄｂｎａｃｄｌｔｄｙｏｌｅｅｈｎｅｉｅｌ．ＡｍｐｉｅｒｍａｉｏｓａｉｎｅｏｃＤｍｉｌｄｆｏＡｒｂｄｐｉｔｌａｇｎｍｉＮＡｎｏｎｃｅｔａｉｏｓｓｐｍｏｅ５ＡＣｉｆｓｈａａｄｃｎｅｔｄｗｉＡｒｂｄｐｉｒｈｏｔｒＳ．ｚＢＦ１—３３ａｄＡｔＣｅｅｒｓｄｔｏｓｒｃｈｏｄ— ｄｃｄｐａｔｅｐｅｓｎｅｔｒｐ＇７．ｈｉｙｆｅＫａａｅｎｒｓｓｎｅｐａｔｒｎｌＥ１ｇｎｓｗｅｅｕｅｏｃｎｔｕｔｔｅｃｌｉｕｅｌｎｘｒｓｉｇｖｃｏＶＣＩｎ２２６Ｔｒ・ｖｎｍｙｉｅｉｔｃｌｎｓｗｅｅｔｉａ
４０１Ｃｉａ２ＣｏｇｉｃｄｍｆｇｅｌｒｌｉｃｓＣｏｇｉｇ４１２，ｈｎ）０７６。ｈ；．ｈｎｑｎｎｇＡａｅｙｏＡｉｕｔａＳｅｅ。ｈｎｑｎ０３９Ｃｉｕｃｎａ

紫茎泽兰F3’H基因表达载体的构建及对烟草转化的研究

紫茎泽兰F3’H基因表达载体的构建及对烟草转化的研究紫茎泽兰是一种世界性的恶性杂草,现已在我国南方和西南地区广泛分布,并且其蔓延速度极快,引起了社会各界的广泛关注。

紫茎泽兰具有很强的化感作用,能分泌化感物质抑制周围植物的生长。

在分泌化感物质的代谢途径中,类黄酮3’-羟化酶(F3’H)能被紫茎泽兰的主要化感成分——泽兰酮诱导,推测其可能与化感作用相关。

通过研究紫茎泽兰化感作用相关的F3’H基因并分析其功能,并且进一步探索紫茎泽兰化感作用的分子机理,研究F3’H基因的部分功能及其在次生代谢中的作用,从而为紫茎泽兰的控制和管理提供理论依据,减少紫茎泽兰所造成的经济损失和减轻其对生态系统的破坏。

本研究构建了F3’H基因的过量表达载体,将其转入烟草体内,并分别进行了生理指标的检测和分子生物学检测。

以实验室保存的含有全长F3’H基因的质粒为模板,设计带有Xba I限制性酶切位点的引物,进行PCR扩增反应。

PCR扩增产物电泳分析后将目的条带回收,与pMD18-T载体连接,命名为F3’H-T。

利用Xba I位点,将经过序列测定正确的目的片段从pMD18-T载体上酶切回收。

同时用Xba I将pBI121植物表达载体线性化,回收的条带经过去磷酸化处理。

接着,将回收的F3’H基因片段和去磷酸化的pBI121载体用T4 DNA连接酶连接,将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中,挑取阳性克隆进行鉴定。

接着利用农杆菌介导的叶盘法把F3’H基因和对照pBI121植物表达载体转化到烟草体内。

结果发现,转F3’H基因烟草的花色偏浅,转空载体(PBI121载体)的烟草花色较转F3’H基因烟草深,但比野生型烟草花色浅,其中有部分转F3’H基因的烟草的花出现条纹状的深浅交错的表型。

表明F3’H基因与次生代谢途径中花色素的形成密切相关。

半定量RT-PCR 结果表明外源基因F3’H在转基因烟草中均能正常转录并表达,且表达量各不相同。

独行菜CBF基因的克隆及其植物表达载体的构建

低温是影响植物地理分布以及产量的一个重要的环境胁迫因子。温带植物经过非冰冻低温胁迫后其抗冻能力得到增加，这种现象称为 “低温驯化 ” ｊ。在低温驯化的过程中导致植物发生多种生理、生化以及分子水平上的变化。包括抗氧化机制的上调，低温防护溶质和蛋白的合成和积累，细胞膜成分发生改变。这些生理、生化、分子水平的变化主要是由于植物在低温胁迫的条件下基因表达发生了改变。因此低温对转录组的激活以及对基因表达的抑制成了低温影响植物
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｈａｄｃｌｏｎｅｄＣＢＦ３ａｎｄＣＢＦ４ｇｅｎｅｓｂｙＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｎｔｓｏｆＬｅｐｉｄｉｕｍａ— ｐｅｔ—ａｌｕｍＷｉｌｌｄ．ＴｈｅｎｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｈｅｇｅｎｅｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＣＡＭＢＩＡ２３００ｗｈｉｃｈｈａｄ３５Ｓ＋．Ｂａｓｉｃａｂｏｖｅａｌ１．ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｈａｄｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗｈｉｃｈｗａｓｓｕｉｔ— ａｂｌｅｆｏｒｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｔｗａｓａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｔｈａｔｆｏｒｎｅｘｔｓｔｅｐｔｏｌｅａｒｎａｂｏｕｔｔｈｅｓｔｒｕｃ－ｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｂｆｇｅｎｅｏｆＬｅｐ—ｉｄｉｕｍａｐｅｔａｌｕｍＷｉｌｌｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＬｅｐｉｄｉｕｍａｐｅｔａｌｕｍＷｉｌｌｄ；ＣＢＦ；ｃｌｏｎｅ；ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

热诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及烟草转化

ｉｎＡｒｉｄＡｒｅａｓ，ＳｈａａｎｘｉＹｎｇａｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｓｅｃｕｉｔｒｙｐｒｏｂｌｅｍｆｏｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｈｓａｂｅｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏ￣ｎｔａｆａｃｔｏｒｓｌｉｍｉｔｉｎｇｔｈｅｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｐｌｎｔａａｔｉｏｎｆｏｔｒａｎｓ・
ＵＸｉａｎｇ — ｌｉ。・ “ ＸＵＧｕａｎｇ — ｅｂ一，ＬＩＺｈｅｎｇ，ＺＨＡＯＨｕｉ．ｘｉａｎ ‘ ．一，ＬＩ
，
ＺＨＡＯＪｉｅ，ＬＩＵＤａｎ，ＷＵＪｉｎｇ。
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅｃｉＳｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＳｈａａｎｘｉＹａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏａｔｒｏｒｙｆｏＣｒｏｐＳｔｒｅｓｓＢｉｏｌｏｇｙ
热诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及烟草转化
徐广博，李政，赵惠贤，刘香利，赵洁，刘丹，吴静
（１．西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵７１２１００；２．旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵７１２１００）

烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

2011-08，32（4）中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 31 烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化王卫锋，太帅帅，王鲁，刘贯山，李凤霞，高晓明，孙玉合*（农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）摘要：腋芽的形成涉及多个调控基因，其中关键基因编码的蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族，它的突变或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。

笔者利用RACE技术克隆了烟草NtLS基因（GenBank登录号EU935581），NtLS与调控植物腋生分生组织形成的基因LS/LAS/MOC1序列高度相似。

本研究从该基因上选取干扰片段，构建了含有反向重复序列的RNAi 干扰表达载体，并通过农杆菌侵染的方法转染烟草W38，以期为NtLS基因的功能研究奠定基础。

关键词：烟草；NtLS；RNA干扰中图分类号：TS413 文章编号：1007-5119（2011）04-0031-05 DOI：10.3969/j.issn.1007-5119.2011.04.008 Construction of RNAi Vector of NtLS Gene and its Transformation in Tobacco WANG Weifeng, TAI Shuaishuai, WANG Lu, LIU Guanshan, LI Fengxia, GAO Xiaoming, SUN Yuhe* (Key Laboratory of Tobacco Quality Control, Ministry of Agriculture, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Qingdao 266101, China)Abstract: Axillary bud formation involves many regulatory genes, one of key factors belongs to the plant specific protein family GRAS. Mutation or function missing of these genes would affect the axillary formation. The tobacco NtLS gene (EU935581) was cloned by RACE technology in our lab. The sequences of NtLS are highly similar to those of LS/LAS/MOC1, which regulate the formation of axillary meristems. The interference fragments were chosen from NtLS and the RNAi expression vectors were constructed and transformed into Nicotiana tabacum W38 by agrobacterium-mediated leaf disc transformation methods, to form basis for further study of NtLS function.Keywords: tobacco; NtLS;RNAi烟叶生产中，打顶之后烟株上的腋芽会迅速发生。

植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析

*基金项目：国家高技术研究发展计划（“863”计划）资助项目（2001AA627020）。

王先艳：女，1978年生，硕士研究生。

**通讯作者。

Author for correspondence.E-mail:<zjr@>.收稿日期：2002-11-21接受日期：2003-04-02农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11(6):554~560·研究论文·植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析*王先艳单晓昳杨爱芳张举仁**（山东大学生命科学学院，济南250100）摘要：利用基因重组，将来自于拟南芥()的发生单个碱基突变的基因插入含有基因的质粒pCAMBIA1300中，由CaMV35S 启动子分别启动和的表达，得到了兼有除草剂抗性基因和耐盐相关基因的植物表达载体。

用烟草叶盘转化法获得了转基因植株。

Southern 杂交检测表明，外源基因已经整合到烟草()基因组中。

抗性测定发现，转基因植株除草剂抗性至少提高了1000倍，而耐盐性提高了约1.0%NaCl 浓度，即带有同样启动子的不同外源基因赋予转基因植株的抗性程度有明显差异。

关键词：基因；基因；耐盐性；抗除草剂；烟草Construction of Plant Expression Vector and Analysis ofHerbicide-resistance and Salt -tolerance of Transgenic TobaccoWang Xianyan Shan Xiaoyi Yang Aifang Zhang Juren**(School of Life Science,Shandong University,Jinan 250100,China)Thegene encodes Na +/H +antiport ,which is the key enzyme to transport Na +into the vacuole to avert thedeleterious effects of Na +in the cytosol,by this way to maintain the osmotic balance in cells and to improve the salt-tolerance of plants.Acetolactate synthase is the key enzyme in the biosynthetic pathway of branched chain amino acids.The mutation of specific base in ofenables the plant to resist herbicide.In the paper,the plant expression vector withandwas constructed by inserting the single dominant nuclear mutated geneofinto pCAMBIA1300-inwhichandwere promoted by CaMV35S promoter respectively.Transgenic tobacco plants were obtained via-mediated transformation.PCR and Southern assay of the transformed plants indicated that the exogenous genes wereintegrated into the genomes of some transgenic plants.In transgenic plants the herbicide-resistance and salt-tolerance were increased by 1000-fold and 1.0%NaCl concentration respectively comparing to the control.Herbicide-resistance of T 1progeny was detected by spraying herbicide lvhuanglong (effective ingredient is chlorsulfuron)of different concentrations at 4-leaf stage.Controls died on 100mg/L lvhuanglong,whereas the surviving ratio of T 1plants still reached 72.7%on 500mg/L lvhuanglong.It is concluded that plasmid of pCAMBIA 1300--could be used to improve the herbicide -resistance and salt-tolerance ofcrops.;;salt-tolerance;herbicide-resistance;tobacco乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase ALS ）是支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸合成途径中的第一个共同的酶[1]。

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华【摘要】According to the sequences of pathogen-inducible plant promoters PPP3 at GenBank,PPP3 promot-ers was cloned from tobacco genome .It was used to replace cauliflower mosaic virus 35 S promoter of pCAM-BIA1301 .The recombinant plasmid was used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101 .The inducibility of the PPP3 promoters in tobacco leaf was evaluated by Agrobacterium tumefaciens-transient genetic transformation as-sye .Real-time quantitative PCR was used to screen the PPP 3 promoters with high inducible expression .The results showed that the gus transcript level under the control of PPP 3 promoters increased respectively 27 .94 fold and 17.69 fold after inoculation with Ralstonia solanacearum and SA.The PPP3 promoter had the advantages such as low basal activity and high expression activity .%根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，扩增PPP3启动子。

枳抗寒性相关转录因子CBF启动子缺失表达载体的构建

枳抗寒性相关转录因子CBF启动子缺失表达载体的构建作者：何利刚，蒋迎春，许淼，等来源：《湖北农业科学》 2013年第21期何利刚，蒋迎春，许淼，仝铸，吴黎明，王志静，孙中海（湖北省农业科学院果树茶叶研究所，武汉４３０２０９）摘要：试验针对枳［Ｐｏｎｃｉｒｕｓｔｒｉｆｏｌｉａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ．］ＣＢＦ启动子序列顺式作用元件预测结果，设计特异引物并ＰＣＲ扩增分离了元件顺序缺失片段，与基本表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１Ｚ连接后转化大肠杆菌ＤＨ５α，提取质粒ＤＮＡ后，通过双酶切、ＰＣＲ及测序筛选出Ｒ０－７、Ｒ３－１０、Ｒ４－８、Ｒ５－１０、Ｒ６－１０、Ｒ７－１０和Ｒ８－１０阳性转化子，成功构建了枳ＣＢＦ启动子缺失表达载体，为枳ＣＢＦ启动子顺式作用元件功能验证奠定了基础，为启动子核心元件筛选和转基因高效抗寒柑橘育种提供理论依据。

关键词：枳［Ｐｏｎｃｉｒｕｓｔｒｉｆｏｌｉａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ．］；抗寒性；ＣＢＦ启动子；表达载体中图分类号：Ｓ６６６；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０13）21－5228-05植物抗寒性相关转录因子ＣＢＦ／ＤＲＥＢ１（Ｃ－ＲｅｐｅａｔＢｉｎｄｉｎｇＦａｃｔｏｒ／Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ－ＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＥｌｅｍｅｎｔＢｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）属于ＡＰ２／ＥＲＦ（ＡＰＥＴＡＬＡ２／Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＥｌｅｍｅｎｔＢｉｎｄｉｎｇＦａｃｔｏｒ）类型转录因子，模式植物拟南芥中由ＣＢＦ１／ＤＲＥＢ１Ｂ、ＣＢＦ２／ＤＲＥＢ１Ａ、ＣＢＦ３／ＤＲＥＢ１Ｃ、ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ组成蛋白质家族，能够特异结合下游靶基因启动子区ＣＲＴ／ＤＲＥ元件，激活下游一系列冷调节基因ＣＯＲ（Ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ）的表达，翻译合成ＲＮＡ结合蛋白、糖转运蛋白、去饱和酶、糖代谢相关蛋白、ＬＥＡ蛋白、ＫＩＮ蛋白、渗透调节物质合成相关蛋白以及蛋白酶抑制剂等细胞保护物质，从而提高植物的抗寒性，被认为是植物冷驯化过程中基因表达调控网络的“主开关”，因此ＣＢＦ转录因子在植物低温响应网络中具有重要作用［１－３］。

山葡萄CBF低温反应途径相关基因的克隆及植物表达载体的构建的开题报告

山葡萄CBF低温反应途径相关基因的克隆及植物表
达载体的构建的开题报告
题目：山葡萄CBF低温反应途径相关基因的克隆及植物表达载体的构建
研究背景：
随着全球气候变化的加剧，气温极端变化的频率越来越高，因此农作物的低温适应性成为了农业生产中的重要问题。

CBF是一类冷信号反应途径中的重要基因，能够促进植物对低温逆境的适应。

近年来对于CBF 途径进行的研究表明，通过对其途径相关基因的研究可以进一步了解CBF途径的机制，进而提高植物的低温适应性。

研究目的：
本研究旨在对山葡萄CBF低温反应途径相关基因进行克隆，并构建植物表达载体，为进一步探究CBF途径的机制提供基础。

研究方法：
1. 通过NCBI数据库中的序列信息，确定山葡萄CBF途径相关基因的序列信息。

2. 设计引物并进行PCR反应，将目标基因扩增。

3. 将扩增后的目标基因进行克隆，并测序验证。

4. 构建植物表达载体，将目标基因插入表达载体中。

5. 将表达载体转化到植物中，确认基因的表达情况。

研究意义：
本研究对于深入探究山葡萄低温适应性的机制以及提高农作物低温适应性具有重要的研究意义。

通过对CBF途径相关基因的研究，可以了
解基因在低温逆境下的表达及调控情况，进而提高植物的低温抗逆能力，为农作物的生产提供技术支持。

转录因子CBF基因转化烟草抗寒性指标的检测

转录因子CBF基因转化烟草抗寒性指标的检测
沙丽娜;郭兆奎;万秀清;程红梅
【期刊名称】《中国林副特产》
【年(卷),期】2009(000)001
【摘要】为了解棉花转录因子CBF 基因转化烟草的抗寒性,将苗龄21 d的转基因及其野生型T2代烟苗进行 0、-1、-2、-3、-4℃低温处理4 h,分别进行各处理材料的电解质渗透率、丙二醛含量和可溶性糖含量的检测.结果表明转基因烟草的电导率和丙二醛含量均低于非转基因烟草,而转基因烟草的可溶性糖含量高于非转基因烟草.证实转CBF 基因可以提高烟株的抗寒性.
【总页数】4页(P4-7)
【作者】沙丽娜;郭兆奎;万秀清;程红梅
【作者单位】黑龙江八一农垦大学植物科技学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学植物科技学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江省烟草科学研究所,牡丹
江,157011;黑龙江省烟草科学研究所,牡丹江,157011;中国农业科学院生物技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S5
【相关文献】
1.冷诱导基因的转录因子CBF1转化油菜和烟草及抗寒性鉴定 [J], 甄伟;陈溪;孙思洋;胡鸢雷;林忠平
2.棉花热激转录因子GhHsf基因的表达及其烟草转化 [J], 萨娜瓦尔·艾比布拉;曲延英;陈全家
3.小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究 [J], 任艳利;崔百明;张秀春;周鹏
4.冷诱导转录因子CBF1转化草莓及其抗寒性鉴定 [J], 金万梅;董静;尹淑萍;闫爱玲;陈梅香
5.棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析 [J], 郭惠明;李召春;张晗;信月芝;程红梅
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植物凝集素基因植物表达载体的构建及遗传转化甘蔗的开题报告

植物凝集素基因植物表达载体的构建及遗传转化甘蔗的开题报告1.选题背景与意义植物凝集素（plant lectin）是一类在很多植物中广泛存在的蛋白质，具有高度的结构多样性和生物功能多样性，在植物的生长发育、病害防御、对环境适应等方面发挥着重要的作用。

植物凝集素结合细胞表面的糖基，可引起受体细胞的聚集和凝集，从而发挥一定的毒素作用。

因此，植物凝集素在对昆虫、真菌等病原体的防御中也发挥着重要的作用。

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是一种广泛栽培的经济作物，具有重要的食糖、生物燃料和化学品生产价值，然而其生长过程中经常受到病虫害的攻击，致使产量和品质下降，因此寻找一种新的、有效的保护甘蔗的方法显得非常必要。

本研究旨在构建植物凝集素基因植物表达载体，并通过遗传转化技术将其导入甘蔗中，以提高甘蔗的抗虫抗病能力，为甘蔗的生产提供技术支持。

2.研究内容和方法2.1 研究内容（1）构建植物凝集素基因植物表达载体：选取具有抗虫、抗病作用的植物凝集素基因，将其克隆到适合甘蔗表达的植物表达载体中。

（2）遗传转化甘蔗：将构建好的植物凝集素基因植物表达载体通过农杆菌介导的遗传转化技术导入甘蔗中，培育获得转基因甘蔗。

（3）观察转基因甘蔗的表型：对转基因甘蔗进行生长发育观察，比较其与野生型甘蔗的表型差异。

（4）检测转基因甘蔗的抗虫抗病能力：通过人工感染病原体和害虫，观察转基因甘蔗的抗虫抗病能力，并与野生型甘蔗进行比较。

2.2 研究方法（1）克隆植物凝集素基因：使用PCR技术从植物中克隆植物凝集素基因，并进行序列分析和比对。

（2）构建植物表达载体：选取适合甘蔗表达的植物表达载体，将克隆好的植物凝集素基因插入载体种，构建植物凝集素基因植物表达载体。

（3）甘蔗遗传转化：将构建好的植物凝集素基因植物表达载体通过农杆菌介导的遗传转化技术导入甘蔗中，筛选获得转基因甘蔗。

（4）观察表型：观察转基因甘蔗与野生型甘蔗的生长发育情况，比较其表型差异。