第二章 料液预处理与细胞破碎
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第2章 细胞分离与破碎
BIOSEPARATION ENGINEERING
另外，向含菌体的料液中加入聚丙 另外，向含菌体的料液中加入聚丙 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 剂，可使菌体之间产生架桥作用而 形成较大的凝聚颗粒。 形成较大的凝聚颗粒。 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 而且还可以在过滤分离中大大提高 过滤速度和质量。 过滤速度和质量。当培养液中含有 蛋白质时． 蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而 同时过滤除去。 同时过滤除去。
1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质 2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）
2 细胞破碎
概述： 概述：
BIOSEPARATION ENGINEERING
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞 外的培养液中，而保留在细胞内。 外的培养液中，而保留在细胞内。 这类生物产物需用上节所述方法收集菌体或细 胞后，进行细胞破碎(cell disruption)，使目 胞后，进行细胞破碎 ， 标产物选择性地释放到液相中。 标产物选择性地释放到液相中。 破碎的细胞或其碎片利用上节所述的固液分离 方法(主要是离心法 除去后， 主要是离心法)除去后 方法 主要是离心法 除去后，上清液用于进一 步的分离纯化。 步的分离纯化。
BIOSEPARATION ENGINEERING
1.3 过滤
利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬 浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法 过滤是一种膜分离法
BIOSEPARATION ENGINEERING
滤液的透过阻力主要来自于：过滤介质和介 质表面堆积的滤饼 滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素 提高过滤速度方法：
BIOSEPARATION ENGINEERING
生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离幻灯片
甲苯破碎酵母 细胞
碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁融解 制丙酮粉 丙酮脱水破坏结合键
剧烈 温和
便宜 高
影响因素：
分子量：大，效果好；过大， 溶解度↓
用量：低浓度增加用量有助架 桥，浓度过高吸附饱和失去架 桥作用，降低了效果。
pH：影响功能团电离度，电离 度↑，链伸展， 效果↑
操作条件：
搅拌：初期，快好；后期， 会破坏絮凝团
〔3〕变性作用
天然蛋白质分子受到某些物理因素〔如热、紫外线照射、 高压和外表张力等〕、化学因素〔如有机溶剂、脲、 胍、酸、碱等〕影响时，生物活性丧失，溶解度降低， 不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。
2.过滤设备 板框过滤机
真空鼓式过滤机
3.过滤介质和助滤剂
〔1〕过滤介质
滤布或膜 耐酸碱、高温、化学试剂、抗拉性能好、有一
定的机械强度和孔隙度等
〔2〕助滤剂 要求为惰性物质、无毒、有一定细度及硬度，
本钱低廉。 参加方法： —预铺法：预铺在过滤机上 — 混合法：与发酵液一起参加 — 生成法：反响中生成沉淀 新生霉素发酵液： 常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等
枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液： 氯化钙+磷酸盐 磷酸钙盐沉淀〔吸附、助滤〕
〔5〕等电沉淀 — 常与其他方法合用
〔6〕加各种沉淀剂沉淀 — 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀
2.多糖的去除
酶：转化为单糖 如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶
粘多糖与一些阳离子外表活性剂如十六烷基溴化 铵〔CTAB〕形成沉淀
3.高价金属离子的去除
〔2〕生物分子对环境反响十分敏感，构造与功能关系 比较复杂，生物活性物质离开生物体后，易变性，破 坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。
碱处理法 碱的皂化作用使细胞壁融解 制丙酮粉 丙酮脱水破坏结合键
剧烈 温和
便宜 高
影响因素：
分子量：大，效果好；过大， 溶解度↓
用量：低浓度增加用量有助架 桥，浓度过高吸附饱和失去架 桥作用，降低了效果。
pH：影响功能团电离度，电离 度↑，链伸展， 效果↑
操作条件：
搅拌：初期，快好；后期， 会破坏絮凝团
〔3〕变性作用
天然蛋白质分子受到某些物理因素〔如热、紫外线照射、 高压和外表张力等〕、化学因素〔如有机溶剂、脲、 胍、酸、碱等〕影响时，生物活性丧失，溶解度降低， 不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。
2.过滤设备 板框过滤机
真空鼓式过滤机
3.过滤介质和助滤剂
〔1〕过滤介质
滤布或膜 耐酸碱、高温、化学试剂、抗拉性能好、有一
定的机械强度和孔隙度等
〔2〕助滤剂 要求为惰性物质、无毒、有一定细度及硬度，
本钱低廉。 参加方法： —预铺法：预铺在过滤机上 — 混合法：与发酵液一起参加 — 生成法：反响中生成沉淀 新生霉素发酵液： 常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等
枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液： 氯化钙+磷酸盐 磷酸钙盐沉淀〔吸附、助滤〕
〔5〕等电沉淀 — 常与其他方法合用
〔6〕加各种沉淀剂沉淀 — 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀
2.多糖的去除
酶：转化为单糖 如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶
粘多糖与一些阳离子外表活性剂如十六烷基溴化 铵〔CTAB〕形成沉淀
3.高价金属离子的去除
〔2〕生物分子对环境反响十分敏感，构造与功能关系 比较复杂，生物活性物质离开生物体后，易变性，破 坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。
生物工艺学第二章发酵液的预处理与固液分离2
收集胞内产物的细胞或菌体，分离除 去液相，
收集含生化物质的液相，分离除去固 体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、 蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。
42
二 常见的固液分离方法
过滤 离心 膜分离 双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA
43
（一） 过 滤
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的 压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过 介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上， 从而实现固液分离的单元操作。
发酵液中的杂质
A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
B.杂蛋白
常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
4
为何要对发酵液进行预处理？
固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度
大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。 因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
24
目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
25
2）天然有机高分子絮凝剂
收集含生化物质的液相，分离除去固 体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、 蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。
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二 常见的固液分离方法
过滤 离心 膜分离 双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA
43
（一） 过 滤
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的 压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过 介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上， 从而实现固液分离的单元操作。
发酵液中的杂质
A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
B.杂蛋白
常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
4
为何要对发酵液进行预处理？
固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度
大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。 因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
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目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
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2）天然有机高分子絮凝剂
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
《生化分离工程》思考题及答案
《生化分离工程》思量题及答案第一章绪论1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。
2、生化分离的普通步骤包括哪些环节及技术？普通说来，生化分离过程主要包括 4 个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调 PH、凝结和絮凝等方法；②初步纯化(提取)，常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化(精制)，常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。
3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？特点： 1、目的产物在初始物料(发酵液)中的含量低； 2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物(几百上千种)、培养基成份、无机盐等； 3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH 值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感； 4、对最终产品的质量要求高重要性：生物技术产品普通存在于一个复杂的多相体系中。
惟有经过分离和纯化等下游加工过程，才干制得符合使用要求的产品。
因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。
在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的 50％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部份占总成本的 40~80％；精细、药用产品的比例更高达 70~90％。
显然开辟新的分离和纯化工艺是提高经济效益或者减少投资的重要途径。
5、为何生物技术领域中往往浮现“丰产不丰收”的现象？第二章预处理、过滤和细胞破碎1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部份可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中(多数是液相)，以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。
：①加热法。
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。
控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝结形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。
第二章_原料的预处理
3. 多孔陶瓷： 一般由熔融的玻璃基与硅酸盐颗粒结合在一起。具有 耐高温、耐腐蚀等特点。 4. 纤维素长带条缠绕滤芯： 由纤维素长带条按螺旋形缠绕而成，带条经过酚醛树 脂浸渍，并通过热处理而硬化。属表面过滤，可用流体逆 洗再生。价廉，强度好，耐热性好，耐腐蚀，易清洗再生。
5. 纤维素非缠绕滤芯： 经过专有的制毡浸渍过程制造的管形滤芯。其纤维密 度沿径向变化，内部较致密，空隙较小。因此大颗粒被外 部截留，小颗粒被内部截留。属深层过滤。
碟式离心机： 化学、制药和生化工业应用最广泛 特点： A、10-100个锥顶角为60-100°的锥形碟片； B、碟片距离很短0.5-2.5mm，沉降距离极短，分离效果高； C、碟片多，沉降面积大，增加分离效果； D、抗对流效果高。 分类： Ａ、人工排渣式; Ｂ、喷嘴排渣式; C、活塞排渣式。
1.5 过滤
（3）凝聚和絮凝： 将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋 白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成 可分离的絮凝体，在进行分离。 特点：使颗粒尺寸增加，增大颗粒的沉降或浮选速率，提高 滤饼的渗透性或在深床过滤时产生较好的颗粒保留作 用。 凝聚：在投加的化学物质（如铝、铁的盐类或石灰等）作用 下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚 体的过程。 絮凝：使用絮凝剂（天然或合成的大分子量聚电解质）将胶
定义：利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子， 进行固液分离的方法。 由于制药工程中过滤的对象大部分是生物体，发酵 液中的微生物细胞等均是易变形的柔软体，一经压缩就会 变形；并且发酵液的粘度也很大，因而发酵液的过滤操作 就显得十分困难。 滤饼过滤：固体粒子在过滤介质表面积累，很短时 间内发生架桥现象，沉积的滤饼也起过 滤介质作用 深层过滤：固体粒子在过滤介质的孔隙内被截留， 固液分离发生在整个过滤介质内部
【2019年整理】生化分离每章练习题
第一章绪论1．生物分离工程在生物技术中的地位？2、生物分离工程的特点是什么？3、生物分离过程的一般流程？4、不同生物物质分离提取常用的单元操作？5. 生化分离和化工分离的主要区别是什么?6.对于氨基酸类物质通常采用哪些分离纯化方法？并说明理由。
7.对于蛋白质类物质通常采用哪些分离纯化方法？并说明理由。
8.提取与精制技术在现代生物化学工程中占有十分重要的地位，与传统化学化工中的分离过程相比，阐述生物技术产品对提取与精制技术的特殊要求及近几年来发展起来的一些新方法新技术。
第二章．发酵液预处理、细胞破碎及固液分离一、名词解释1. 凝聚和絮凝答：（1）凝聚：在中性盐的作用下，可以使菌体表面双电位层排斥，电位下降（即中和沉淀物质的电荷）。
（2）凝絮：向含菌的料液中加入高分子絮凝剂，可使菌体之间产生架桥作用而产生较大的凝聚颗粒。
2．渗透压冲击法破碎细胞答：是较温和的一种破碎细胞的方法，将细胞放在高渗透压的介质中，达到平衡后介质突然被稀释或者将细胞转入水中或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。
渗透压冲击法仅对细胞壁较脆弱的或者细胞壁预先用酶处理的或合成受抑制而强度减弱时才是适合的。
3．高压匀浆细胞破碎法答：细胞悬浮液在高压作用下，从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境中，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。
此法不适用于团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌及含有包含体的基因工程菌。
适用于酵母菌和大多数细菌细胞的破碎。
4．超声波破碎法答：细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性漩涡在介质的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。
适用于多数微生物细胞的破碎。
5．差速离心答：主要采用逐渐提高离心速度的方法分离不同大小细胞器的方法。
二、单项选择题1. 去除高价金属离子Mg2+，加入( B ) 试剂。
12级生物分离工程期中复习题
12级生物分离工程期中复习题第一章绪论1. 简述生物分离工程在生物技术中的地位？答：生物技术的主要目标是利用培养微生物、动物细胞、植物细胞来生产对人有用的产品，而分离纯化过程是生物产品工程的重要环节。
因此，生物分离工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术转化为生产力所不可缺少的重要环节，在生物技术研究和产业发展中发挥着重要作用，其技术进步程度对于保持和提高各国在生物技术领域内的经济竞争力有至关重要的作用。
2. 生物分离工程的特点是什么？答：生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。
生物工程的主要特点是生物制品多种多样; 常无固定操作方法可循;生物材料组成非常复杂, 分离操作步骤多，不易获得高收率; 培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高; 分离进程必须保护化合物的生理活性; 生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏。
3. 生物分离工程都有哪些单元操作？请举例说明。
发酵液的预处理、产物的提取、产物的精制、成品的加工处理。
不溶物的去除包括过滤、离心和细胞破碎，通过这些单元操作使产物浓度和质量得到了提高。
产物分离包括离子交换吸附、萃取等。
其中萃取又分为溶剂萃取、反微团萃取、超临界流体萃取和双水相萃取等。
以上分离过程不具备特异性，只是进行初分可提高产物浓度和质量。
产品的纯化包括色谱、电泳、沉淀等单元操作，这些技术具有产物的高选择性和杂质的去除性。
产品的精制包括结晶及干燥等单元操作。
第二章发酵液的预处理与细胞破碎1、发酵液有那些特性？❖1、发酵产物浓度较低。
❖2、发酵液是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类及无机盐等多种物质的混合物。
且悬浮物颗粒小，固体粒子可压缩性较大。
❖3、发酵液性质和产物性质不稳定。
其性质易受空气氧化、微生物污染以及蛋白酶水解等作用的影响；各批次发酵液的性质也不尽相同；pH值、离子强度和温度等变化常常造成产物的失活。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
细胞的分离和破碎
第 二 章 细胞分离与破碎 Cell isolation and disruption
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CONTENTS
2.1 发酵液的预处理
壹
请在此添加较简洁标题内容
贰
请在此添加较简洁标题内容
去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作 杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等
预处理的具体方法
高价无机离子的去除方法
去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解
度较小，不适合用量较大的场合。
去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。
去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
杂蛋白质的除去 沉淀法 盐析 调节pH→pI 吸附法 加入吸附剂或沉淀剂 变性法 加热，大幅度调节pH，加有机溶剂或表面活性剂等。
胶体双电层的构造
絮凝
指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大（10mm）的絮凝团的过程。
絮凝剂的分类
根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类：
絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。
3. 机械破碎法与非机械法的比较
比较项目
机械法
非机械法
破碎机理
切碎细胞
溶解局部壁膜
碎片大小
细小
较大
内含物释放
全部
部分
黏度
高（核酸多）
低（核酸少）
时间，效率
时间短，效率高
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CONTENTS
2.1 发酵液的预处理
壹
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贰
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去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作 杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等
预处理的具体方法
高价无机离子的去除方法
去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解
度较小，不适合用量较大的场合。
去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。
去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
杂蛋白质的除去 沉淀法 盐析 调节pH→pI 吸附法 加入吸附剂或沉淀剂 变性法 加热，大幅度调节pH，加有机溶剂或表面活性剂等。
胶体双电层的构造
絮凝
指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大（10mm）的絮凝团的过程。
絮凝剂的分类
根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类：
絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。
3. 机械破碎法与非机械法的比较
比较项目
机械法
非机械法
破碎机理
切碎细胞
溶解局部壁膜
碎片大小
细小
较大
内含物释放
全部
部分
黏度
高（核酸多）
低（核酸少）
时间，效率
时间短，效率高
2 发酵液的预处理细胞破碎与固液分离
转速（r/min) 2000-6000
10000-26000 30000-12000
蛋白质
超离心法（实验室用）
分为：差速离心，区带离心。
差速离心(differential centrifugation) 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分 离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低， 让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬 浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心 速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此 类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞 碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高， 该法对冷冻—融解敏感的生化物质不适用。
图2.16 喷雾撞击破碎器的结构简图
（4）超声波法
细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产 生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性 旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使 细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。
2.1.2.1 过滤
（1） 影响过滤速度的因素
• 菌种 • 发酵条件
–培养基的组成 –未用完培养基的数量 –消沫油 –发酵周期
菌种对过滤的影响
真菌 ：菌丝粗，易过滤，不需特殊处理，可 用真空转筒过滤机。如青霉菌的菌丝直径可达 10μm。 放线菌 ：菌丝细而分支，交织成网络状，过滤 困难，一般须预处理。链霉素菌丝：0.51.0μm。 细菌 ：菌体更细小，过滤十分困难，如不用 絮凝等方法预处理，很难用过滤和分离法操作。
•
絮凝
• 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的 胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮 团，这就是絮凝作用。 • 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分 子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其 链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子 （如—COOH）或阳离子（如—NH2）基团以及不 带电荷的非离子型基团。 • 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强 烈地吸附在胶粒的表面。
第二章_原料的预处理
18 l
由于菌体细胞的直径很小，沉降速度很慢，因此常需向菌 体的料液中加入絮凝剂，使菌体细胞凝聚成较大颗粒后过滤除 去。
1.4 离心沉降（适用于分离较小的颗粒）
广泛应用于固液、液液相的分离。 1.离心沉降速度
d 2 s 2 R Vs 18
令：
S=
2 dp ( s L )
（3）凝聚和絮凝： 将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋 白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成 可分离的絮凝体，在进行分离。 特点：使颗粒尺寸增加，增大颗粒的沉降或浮选速率，提高 滤饼的渗透性或在深床过滤时产生较好的颗粒保留作 用。 凝聚：在投加的化学物质（如铝、铁的盐类或石灰等）作用 下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚 体的过程。 絮凝：使用絮凝剂（天然或合成的大分子量聚电解质）将胶
平衡区带离心（等密度离心法）: 在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包 含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度 液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心 力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来 分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒 子的密度，即ρL＞ρs时粒子上浮；在弯顶处ρs＞ρL时，则粒子 沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρs＝ρL，此 时粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，区带与样品粒子 的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转 速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带 位置。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。 常用的梯度液是CsCl。
18 L
S为Байду номын сангаас降系数
从该式中可看出：
①当ρs＞ρL，则S＞0，粒子顺着离心方向沉降。 ②当ρs＝ρL，则S＝0，粒子到达某一位置后达到平衡。 ③当ρs＜ρL，则S＜0，粒子逆着离心方向上浮。 离心沉降时，颗粒的相对分子质量越大，沉降系数越大，离心沉降速 度越大。
第二章 生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离
胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易失活。 特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构比较紧密,一 般方法不易将细胞打破,有些技术虽然可以,但条件严 苛,胞内生物活性物质在此条件下很易失活,限制了一 些技术的应用。 在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。
细胞破碎
通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击 而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞 壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度 不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破 碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破 碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
去除Ca2+，常用草酸钠或草酸，形成草酸钙沉淀 去除Mg2+，可用草酸、磷酸盐、三聚磷酸钠等 去除Fe3+，加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀
问题
1、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其 简要机理如何？ 2、除去发酵液中杂蛋白的常用方法有哪些？ 3、如何去除发酵液中的多糖、金属离子？ 4、凝聚和絮凝有哪些不同之处？
第三节 细胞破碎
一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之 外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和 保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位 成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培 养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固 －液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即 可。其后续分离和纯化都相对简单。
高压匀浆法
影响细胞破碎的主要因素：压力、循环次数、温 度。 操作压力：50～70MPa，一般为55MPa 一次破碎率：12%～67%，达到90%要多次 提高操作压力，有利于破碎，减少循环次数 温度由5℃提高到30℃，酵母破碎率提高1.5倍 适用于酵母和大多数细菌的破碎。 不适用于高度分枝的微生物，因为会堵塞阀。
第二章_细胞破碎技术
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖占 40 ％一 90％，其余是多糖和磷壁酸。 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，最外面还有一 较厚的外壁层，外壁层主要由脂蛋白，脂多糖 组成。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取决 于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的 程度，如果交联程度大，则网结构就致密。
W S K 卧 式 高 效 全 能 珠 磨 机
ZM 系 列 卧 式 密 闭 珠 (砂) 磨 机
（三）超声破碎法 工作原理：利用超声波振荡器发射的1525kHz的超声波处理细胞悬浮液，由于超 声波的空化作用而使细胞破碎。 特点：超声波振荡容易引起温度的剧烈 上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入 冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比 原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真 核细胞也具有一层细胞膜。 除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作 用的细胞器。 植物和大多数真菌具有细胞壁。
动 物 细 胞 模 式 图
植 物 细 胞 模 式 图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞 壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁 是细胞生长时期形成的。次生壁是细胞停 止生长后，在初生壁内部形成的结构。
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄 球菌、链球菌。 革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。 大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
微生物 壁厚（nm） 层 革兰式阳性菌 革兰式阴性菌 酵母 20～80 单层 肽聚糖(40~90%) 多糖 胞壁酸 主要组成 蛋白质 脂多糖 破碎难易程度 难 10～25 100～300 多层 多层 肽聚糖(5~10%) 葡聚糖(30~40%) 脂蛋白 甘露聚糖 （30％） 脂多糖 磷脂 蛋白质 蛋白质 脂类 相对易 最难
2 发酵液的预处理细胞破碎与固液分离
过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
–滤饼的可压缩性问题 –小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到 转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层 的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤 剂可以解决这一问题
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂的加入有两种方法
在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)， 该方法，会使滤速降低，但滤液透明 度增加。
特点
对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不 同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰 氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。该 法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的 能量来提供必要的冷却，这是困难的。
超 声 波 破 碎 仪
2.2.3.2 化学和生物化学渗透
酸碱处理 可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组 分从细胞内渗漏出来。
区带离心（Zonal centrifugation）
密度梯度制作： • 先调配不同浓度（密度）的蔗糖溶液，然后在离 心管中以浓度从大到小层层加入即可。 • 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速离心后 可制成连续的蔗糖密度梯度。 • CsCl 和NaBr在离心力的作用下可自动形成密度 梯度。
区带离心：差速区带离心和平衡区带离心。
袋 式 过 滤 机
2.1.2.2 离心
优点：分离速度快，分离效率高、液 相澄清度好，操作时卫生条件好； × 缺点：设备投资高、能耗大。
表2.3 离心机的种类和适用范围
项目 离心力
细胞 细胞核 细胞器
低速离心机 2000-7000g
高速离心机 8000800000g
超离心机 100000600000g
2.1.1.2 改善培养液的性能
主要通过降低发酵液的黏度、调节适宜的pH 值和温度、絮凝与凝聚等操作来实现
第二章 料液预处理与细胞破碎
表面活性剂
49
化学破碎法
► 优点
对产物的释放具有一定的选择性； 细胞保持完整，碎片少，料液粘度低，易于固液 分离。
► 缺点
通用性差，某种试剂只能作用于特定类型的细胞； 时间长，效率低，产物释放率低； 有些化学试剂有毒。
50
酶溶法（Enzymatic lysis）
破碎原理
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，部分或 完全破坏细胞壁，增大胞内产物的通透性。
14
高价无机离子的去除方法
1.Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀； 2.Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可 溶性络合物； 3.Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀
15
第二节 细胞破碎 （Cell disruption）
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 固液分离 离心，过滤 ) ( 细胞分离 离心，过滤 ( ) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 溶解( 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )
但对真菌菌丝和藻类更合适。 ► 有效能量利用率很低。 ► 设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能 力。 ► 影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计 较复杂。
39
撞击破碎
破碎原理
细胞冷冻后成为易于破碎的刚性球体， 高速载气（高速氮气流，约300m/s） 使细胞高速撞击固定的撞击板而破碎。
40
撞击破碎
2预处理和菌体的破碎
：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。
2.7 细胞破碎技术
影响因素
a) 转盘外缘速度(见下图)： 适合条件：圆盘外缘速度 < 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。
b) 珠粒添量和大小 添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%) 粒径：一般在0.2mm(实验室), < 0.4 mm(工业)。最终由实验确定
气浮分离：在水中通入或设法使水体产生大量微细气泡，附着于杂质颗粒上，密度小于水而浮至水面， 从而获得分离的一种澄清方法。 预处理发酵液的目的:改变发酵液的物理性质(黏度、颗粒 、颗粒稳定性等)，固液分离速度 ，分离器 分离效率 ；目标产物转移其中一相(多数为液相)；去杂质 破碎法分类：物理法，化学法，分别有几种类型 固体剪切法(珠磨法, 最有效的物理破碎法) 液体剪切法(最常用的方法之一) 撞击破碎法 超声破碎法 化学破碎法
2.8 破碎方法的选择
选择的一般原则
A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械 法结合的方法
破碎技术杂交研究应注意的问题
A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物 的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的 影响 D、菌种的培育，胞内产物 胞外产物
2.3 悬浮液的预处理
凝聚剂 : 指的是让不稳定的胶体微粒（或者凝结过程中形成 的微粒）聚合在一起形成集合体的过程中所投加的药剂的统 称。 种类：A、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、 FeCl 3、AlCl3、ZnCl 、硫酸镁等；B、无机碱，如Al(OH)3、 Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；C、聚合无机盐，如聚合铝、 聚合铁。 机理： A 、破坏双电层， B 、水解后胶体吸附， C 、氢键结 合等。
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但对真菌菌丝和藻类更合适。 ► 有效能量利用率很低。 ► 设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能 力。 ► 影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计 较复杂。
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撞击破碎
破碎原理
细胞冷冻后成为易于破碎的刚性球体， 高速载气（高速氮气流，约300m/s） 使细胞高速撞击固定的撞击板而破碎。
40
撞击破碎
14
高价无机离子的去除方法
1.Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀； 2.Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可 溶性络合物； 3.Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀
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第二节 细胞破碎 （Cell disruption）
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 固液分离 离心，过滤 ) ( 细胞分离 离心，过滤 ( ) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 溶解( 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )
53
常用酶
细胞壁溶解酶 β-1，6-葡聚糖酶 甘露糖酶
5
预处理目的
► 促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固
液分离的效率。
改变原料液的物理性质，包括增大悬浮液中固体 粒子的尺寸，降低液体黏度； 将产物转入便于后处理的相中（多数为液相）； 除去部分杂质。
6
预处理方法
1、加热法
将原料液加热到目标产物稳定的温度范围内。 能够降低黏度、促凝聚、部分杂蛋白变性沉淀；
3
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
预处理（Pretreatment ）
采用凝聚和絮凝等各种方法来加速固相、
液相分离，提高过滤或离心速度。
4
为何要对料液进行预处理？
► 料液的基本特性
料液的成分很复杂，目标物质浓度较低，大多为 1-10%； 悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似； 可压缩性； 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动。
23
破碎效率的评价
►
破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百 分数。
Y% =
►
(N 0 - N )
N0
*100%
细胞数量的确定
直接计数法：血球板计数 间接计数：测定破碎后悬浮液中蛋白质或酶等的含 量
24
高压匀浆 （High-pressure homogenization）
破碎原理
利用高压使细胞悬液从阀座与阀之间的环 隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受 到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境， 从而在撞击力和剪切力等综合作用下破裂。
表面活性剂
49
化学破碎法
► 优点
对产物的释放具有一定的选择性； 细胞保持完整，碎片少，料液粘度低，易于固液 分离。
► 缺点
通用性差，某种试剂只能作用于特定类型的细胞； 时间长，效率低，产物释放率低； 有些化学试剂有毒。
50
酶溶法（Enzymatic lysis）
破碎原理
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，部分或 完全破坏细胞壁，增大胞内产物的通透性。
1、四环素类抗生素由 于能和Ca2+、Mg2+离子 等形成不溶解的化合物， 大部分沉积在菌丝体内， 用草酸酸化后，抗生素 转入水相。
2、链霉素在中性发酵 液中，约有25%在菌丝 内，当酸化后就能逐步 释放出来。
8
预处理方法
3、凝聚
在凝聚剂作用下, 胶体去稳定，并聚集成1mm大 小的凝聚块的过程。
机理：
51
酶溶法
► 自溶（autolysis）
诱使细胞产生溶解自身的酶的特殊酶溶法。 如酵母在45－50℃下保温20小时，可发生自溶。 乳糖发酵短杆菌发酵生产谷氨酸，利用pH10的缓 冲液配成3%的悬浮液，加热到70℃，保温搅拌 20min，发生自溶。
52
常用酶
溶菌酶 （Lysozyme）
用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解， 用于革兰氏阴性菌时，需添加EDTA。
不同微生物细胞壁比较
微生物
壁厚 （nm） 层次
革兰氏阳 性菌
20－80
革兰氏阴 性菌
10－13
酵母菌
100－300
霉菌
100－250
单层
肽聚糖 （40－90％） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖
多层
肽聚糖 （5－10％） 蛋白质 脂蛋白 脂多糖 磷脂
多层
葡聚糖 （30－40％） 甘露聚糖 （30％） 蛋白质 脂类
► 很强烈的破碎方法； ► 适用多数细胞的破碎； ► 能量利用率极低，操作过程产生大量的热； ► 多在实验室使用。
47
化学破碎法
破 碎 原 理
用酸、碱、表面活性剂、有机溶剂 或变性剂等处理细胞， 增大细胞壁或细胞膜的通透性， 或者降低胞内物质间相互作用， 使目标产物易于释放。
48
化学破碎法
酸碱 化学 破碎 有机溶剂 变性剂
第二章
料液预处理与细胞破碎
第一节 料液预处理 第二节 细胞破碎 第三节 蛋白质的复性
分离工艺实例
1
第一节 料液预处理
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 固液分离 离心，过滤 ) ( 细胞分离 离心，过滤 ( ) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 溶解( 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )
31
高压匀浆的特点
► 适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎；
► 不宜用于团状或丝状真菌及较小的革兰氏
阳性菌的破碎； ► 质地坚硬的亚细胞器（如包涵体），易损 伤阀座，不适宜该法处理； ► 由于操作中温度会升高，需对料液作冷却 处理，保护目的产物活性。
32
高速珠磨法
（High-speed bead mill）
多层
多聚糖 （80－90％） 脂类 20 蛋白质
主要组成
细胞的结构
► 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易
程度也不同，由难到易的大致排列顺序为： 植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性 细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。
► 破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到
不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产 物。
35
Netzsch LM-20型珠磨机
园盘以两种位臵交错地安装在轴上， 一种处于径向，一种与轴倾斜， 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。 由于交错的运动，提高了破碎效率。
36
高速珠磨法
► 破碎作用符合一级反应动力学，破碎程度常
用细胞破碎率（％）或单位细胞释放出的内 含物（mg/g）来表示。现采用破碎率表示， 其动力学方程为： 间歇操作： 连续操作：
18
常见的胞内产品
产物 生产菌 用途 治疗急性淋巴 Escherichia coli 癌
L－天冬酰胺酶
过氧化氢酶 β-半乳糖苷酶 α-干扰素 胰岛素
Aspergillus niger Saccharomyces lactis Escherichia coli Escherichia coli
脱除H2O2 水解乳糖 治疗白血病 治疗糖尿病19
21
细胞破碎法
细胞 破碎法 机械法 非机械法
Байду номын сангаас
珠磨法 匀浆法 超声法
物理法
冻融法 渗透压法
化学法
有机溶 剂法 表面活 性剂法
生物法
酶法
22
细胞破碎原理
► 机械法破碎
细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。 细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破 碎。
► 非机械法破碎
利用化学试剂、生化试剂（酶）或物理性质 改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的 溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生 质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释 放胞内物质。
1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构 3）破坏水化膜
常用凝聚剂： A、无机盐类， 如硫酸铝、明矾等； B、无机碱，如 Al(OH)3、Fe(OH)3等。
9
预处理方法
4、絮凝
使用絮凝剂将胶体颗粒交连成网，形成10 mm 大小的絮凝团过程。
机理：架桥作用。
10
絮凝剂
►
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分 子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其 链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非 离子型基团。
25
高压匀浆
26
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
27
高压匀浆器的种类
► 高压匀浆器的种类较多：
WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
28
意大利Niro Soavi-NS1001L型实验室级 高压匀浆器 高压匀浆机
29
高压匀浆
破碎动力学方程：
1 α ln kNp (1 S)
其中：
R S Rm
S－破碎率 k－速率常数 N－循环次数 p－操作压力
30
主要影响因素
细胞种类
影响k值
操作压力p 影响 因素
p, R ;相反, R 。 温度 2C /10MPa。