食品中霉菌检测方法探究

食品中霉菌检测方法探究
作者：施震地
来源：《沿海企业与科技》2012年第12期
[摘要] 目的：研究食品中霉菌的检测方法。

方法：釆用不同的培养基、不同的接种方法对食品中的霉菌进行检测。

结果：孟加拉红培养基和倾注法更适合进行食品中霉菌的计数。

[关键词] 霉菌；孟加拉红培养基；马铃薯葡萄糖培养基；倾注法；涂布法
[作者简介] 施震地，启东市产品质量监督检验所工程师，江苏启东，226200
[中图分类号] D155.5 [文献标识码] A [文章编号] 1007-7723（2012）12-0006-0003
霉菌广泛分布于自然界中，同时由于其可形成各种微小的孢子，因而很容易污染食品。

霉菌污染食品后不仅可造成腐败变质，而且有些霉菌还可产生毒素，人畜因误食霉菌毒素而中毒。

霉菌毒素是霉菌产生的一种有毒的次生代谢产物，自从20世纪60年代发现强致癌的黄曲霉毒素以来，霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。

我国在2011年颁布了国家标准GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》，各级食品监督检测机构全面开展霉菌的检测工作。

本文主要对日常食品中霉菌的检验方法及检验过程中遇到的几个问题进行探讨。

一、检验方法的选择
国内现行有效的食品中霉菌的检测方法有两种：一种是GB4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数[1]；另外一种是食品中霉菌和酵母计数 PetrifilmTM测试片法[2]。

这两种方法主要区别如下：
1. 样品稀释液的不同。

测试片要求1%的蛋白胨水或者磷酸盐缓冲液，而国标方法使用灭菌的蒸馏水即可。

2. 相对于国标法，测试片法操作起来简洁方便，不用对大量的培养皿进行灭菌，不用制备培养基，样品稀释后直接接种，省时快速。

3. 测试片法所用的测试片价格比较昂贵。

综上所述，一般情况下我们还是选择国标法。

二、培养基的选择
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。

目前国标方法中使用的培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、孟加拉红培养基（RBC）。

我们用这两种培养基对相同样品同时进行培养，有以下发现：
1. 在培养基配制过程中， PDA培养基能完全溶解，但澄清度不够；而RBC能完全溶解，溶解后清亮透明（见图1）。

RBC倾注后在较短的时间就会凝固，而PDA则需要更长的时间。

2. 霉菌在PDA培养基与RBC培养基都生长良好，但由于PDA培养基有无法完全溶解的细小白色粒子，与白色的霉菌菌落在一起，常常会干扰我们对霉菌的计数；而RBC上生长的都是红色菌落，而且无细小粒子的干扰，便于准确计数（见图2）。

三、接种方式
常用的微生物接种方式主要有倾注法和平板涂布法。

国标方法中采用倾注法，然而有实验和报道证实[3]，霉菌计数采用涂布法更合适。

日常检验中我们对倾注法和平板涂布法进行比较：
1. 在操作上：倾注法要求将培养基溶化之后冷却至45℃左右，手感不烫，再注入培养皿中，但在实际操作中，很难精准地控制培养基温度。

培养基温度过高可能会使霉菌孢子受热损伤甚至死亡，而等待培养基冷却，会使霉菌稀释液保持时间过长。

如果培养基过度冷却，便无法倾倒注入培养基中。

所以在平时的检验过程中，一是注意样品稀释与培养基冷却应同步进行；二是利用恒温水浴让培养基保持温度，从而可以避免以上情况的发生。

2. 涂布法培养所需的时间较短，培养出的霉菌菌落数较多，霉菌孢子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。

这是因为绝大多数霉菌属于好氧型，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育会受到影响。

3. 涂布法是先制备培养基，后接种，因而可以检查培养基是否染上杂菌。

4. 由于涂布法吸收量较少，操作比较麻烦，如果平板干燥效果不好，容易使霉菌生长蔓延。

涂布过程必须均匀，否则不利于单个菌落生长。

倾注法要求每个稀释度吸取1mL，便于菌落的计数；采用涂布法，培养基通常表面涂0.1mL的量，对于霉菌菌落的计数就不够准确；而如果涂布1mL的量，等待干燥的时间过长，有时也会出现无法完全干燥的现象，霉菌得不到更好的培养，也就无法准确计数。

5. 在日常检测中，通常采用涂布棒进行样液的涂布，由于涂布棒会附着少量的样液影响接种量。

所以，我们在实践中吸取一定量的样液后，旋转平板，让样液尽量均匀地布满整个培养基，也能达到涂布的效果。

同时发现在PDA培养基上样液不容易流动分布，而RBC上的样液经转动平板，样液较易均匀分布（见图3）。

四、培养温度
培养温度按照国标规定，一般情况下都采用28℃±1℃培养。

同时也发现在培养温度低于25℃或高于30℃时会直接影响霉菌的生长。

五、培养时间
正常培养条件下，培养3～4天的菌落数与5～6天的基本相同，但菌种的特征不明显。

因此，如果只要作霉菌计数，培养3～4天已基本达到目的，但对于无菌落的，则需要培养更长的时间。

曾经在检验过程中发现几种霉菌生长特别快、菌丝很多，在培养后第二天就可计数，如再延长培养时间菌丝就会覆盖整个平皿，无法准确计数。

这类霉菌污染比较普遍，检测这类样品，应提早观察记录。

如图4，同样的样品在两个RBC培养基上进行涂布接种，一个培养了2天，一个培养了5天。

六、菌落计数
霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散。

在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差。

因此，选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。

通常选择产品标准最上限规定来选择三个稀释度，再按照国标的计数方法进行结果报告。

对污染较重的样品需要增加一个稀释度，以便结果更为准确。

七、结语
1. 如果被检验食品的数量很大时，建议采用测试片法，可以缩短检验时间，缩短整个检验周期。

2. 涂布法与倾注法的选择，在样品量较多时，选择倾注法可以提高效率，前提是要控制好培养基的温度；而涂布法更适宜霉菌的鉴定，而且在涂布时必须要涂布均匀。

3. 由于霉菌检测所需的时间较长，中间必须进行多次观察，因此在实验前要做好实验计划，确定观察记录的时间。

通常在培养24h后就应该进行观察，对生长迅速的，菌丝很长的一类霉菌48h后就可计数。

4. 霉菌孢子易在空气中传播，所以检验时应必须在霉菌实验室进行，整个检验过程保持平静，减少空气流通；操作时动作要快、轻，特别是培养过程中，如果观察时动作过大，早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散，形成新的菌落，导致结果不准确。

5. 从霉菌接种开始时，应在操作台旁打开两块灭菌平皿，待接种结束后，浇注培养基，和检样同时进行霉菌培养，对整个接种过程进行验证，可发现在整个接种过程中是否受环境污染。

6. 检验前应认真做好全面的消毒灭菌工作，检验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌，以防进一步污染。

[参考文献]
[1]中华人民共和国国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数[S].
[2]中华人民共和国国家标准SN/T 2566-2010食品中霉菌和酵母计数 PetrifilmTM测试片法[S].
[3]Matsuda，H. Comparative study of the spread plate and pour plate techniques in terms of colony forming units of fungi [J].Journal of Antibacterial Antifung Agent. 1995（23） 613-618.。