基因打靶技术.

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基因打靶：是利用同源重组技术来定点改 变物种的基因组顺序和结构，从而在突变 的个体内来研究基因及基因组的功能。
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基因敲除：是使基因组中某个/某几个 基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而 在突变体内丧生正常的功能，来推测这 些基因或元件原来在体内的功能。 基因敲入：在个体基因组中定点加入某 个/某几个基因或顺式元件，使之表达 或发挥作用，从而研究该基因或顺式元 件在体内的功能。
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ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持 未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞 类型的细胞。自从1981年美国的Gail和英国 的Evans等 分别成功地从发育中的小鼠囊胚 的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎 干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种 最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中 得到具有胚胎干细胞相似特性的细胞群， 称为胚胎种系(embryonic germ，EG)细胞。
马里奥· 卡佩奇 马丁· 埃文斯
奥利弗· 史密斯
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建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因 打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生 物活体遗传信息的实验手段。通过对生物 遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传 信息在生物活体内遗传，表达突变的性状， 从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传 进化，疾病发生的分子机制，提供相关的 疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治 疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究 的重要技术手段。
二、基因打靶原理
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生物界同源重组现象的发现，为基因打 靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细 胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛 应用。 同源重组(Homologous recombination)又 称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗 传信息的过程, 外源DNA段可与宿主基因 组的相应片段发生交换（即重组）。
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胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合 体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的 一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的 特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛 地应用于建立转基因动物之中。从80年代 到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已 发展到成熟阶段。
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1984年， Bradly等成功地用显微注射法将 ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠， 获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获 得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首 次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发 育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子 代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除 (Gene knockout)的动物模型。此后，这项技 术得到了普遍应用和长足发展。
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基 因 打 靶 流 程 图
一、基因打靶研究的背景
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目前的基因转移技术，如显微注射、电 穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感 染等方法，已能有效地将外源基因导入 靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶 细胞基因组中整合的位点一般是随机的， 可能导致下面几种情况出现：
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①导入的外源基因整合入某一正常基因的 中部，导致该正常基因表达的缺如； ②导入的外源基因整合入细胞内正常基因 的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活 性； ③外源基因的导入有可能激活细胞内的原 癌基因； ④导入的外源基因由于其整合位点的不适， 而在细胞内不表达或表达难以控制。
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早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼 色遗传的分析揭示了同源染色体之间的 DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺 乳动物细胞中实现了同源重组。基因打靶 通常是指用含已知序列的DNA片段与受体 细胞基因组中序列相同或相近的基因发生 同源重组，整合至受体细胞基因组中并得 以表达的一种外源DNA导入技术。
基因打靶技术及研究进展
2007诺贝尔奖专题
王廷璞
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瑞典卡罗林斯卡医学院10月８日宣布， ２００７年诺贝尔生理学或医学奖授予 来自美国的马里奥· 卡佩奇、奥利弗· 史密 斯和来自英国的马丁· 伊文思因胚胎干细 胞研究获该奖项。
这三位科学家是因为“在涉及胚胎 干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系 列突破性发现”而获得这一殊荣的。这 些发现导致了一种通常被人们称为“基 因打靶”的强大技术。这一国际小组通 过使用胚胎干细胞在老鼠身上实现了基 因变化。就是 将外源基因导入预先确定的位点。即对细 胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶， 而研究该基因的功能或在生物发育中的作 用。随着人类及四十多种微生物基因组测 序的完成，发现了大量未知功能的基因， 应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向 修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。 因此，基因打靶就日益成为继基因转移技 术后亟待发展的新技术。
四、外源DNA导人的方式
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外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔 法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最 广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射 法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA 细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个 细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。 Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定 转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细 胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶， 在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
三、打靶载体的构建
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基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中 同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶 载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基 因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型 载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位 点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复， 从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线 性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线 性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体 序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载 体进行基因打靶。