金黄色葡萄球菌的致病性及检测技术
实验金黄色葡萄球菌的检验
实验金黄色葡萄球菌的检验实验5金黄色葡萄球菌的检验1目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。
此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。
因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA 酶。
3实验材料3.1检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。
3.3培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。
3.5仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。
4检样程序5操作步骤5.15.1.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。
若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
5.1.2增菌和分离培养将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。
金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
金黄色葡萄球菌实训报告
一、实验目的1. 熟悉金黄色葡萄球菌的基本生物学特性。
2. 掌握金黄色葡萄球菌的分离、纯化及鉴定方法。
3. 了解金黄色葡萄球菌的致病性及防治措施。
二、实验原理金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种革兰氏阳性球菌，广泛存在于自然界和人类及动物体内。
该菌具有高度的致病性，可引起多种化脓性感染，如肺炎、败血症、心内膜炎等。
实验中，通过观察金黄色葡萄球菌的形态特征、生化反应和药物敏感性，实现对金黄色葡萄球菌的鉴定。
三、实验材料1. 金黄色葡萄球菌菌种：购自某生物技术公司。
2. 实验器材：显微镜、无菌操作台、接种环、接种针、无菌培养皿、营养琼脂、血液琼脂、药敏纸片、生理盐水、75%酒精、碘酒、显微镜油镜等。
3. 实验试剂：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素等药敏纸片。
四、实验方法1. 金黄色葡萄球菌的分离与纯化（1）接种：将金黄色葡萄球菌菌种接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时。
（2）挑取单菌落：用接种环挑取生长良好的单菌落，接种于新的营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时。
（3）重复挑取：继续挑取单菌落，直至获得纯化后的金黄色葡萄球菌。
2. 金黄色葡萄球菌的形态特征观察（1）革兰氏染色：将纯化后的金黄色葡萄球菌涂片，进行革兰氏染色，显微镜下观察。
（2）菌落观察：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时，观察菌落形态。
3. 金黄色葡萄球菌的生化反应鉴定（1）糖发酵实验：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于糖发酵培养基，37℃恒温培养24小时，观察是否产生气泡。
（2）氧化酶实验：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于氧化酶培养基，37℃恒温培养24小时，观察是否产生颜色变化。
4. 金黄色葡萄球菌的药物敏感性实验（1）药敏纸片法：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂平板，将药敏纸片贴于平板表面，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。
（2）最低抑菌浓度（MIC）测定：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于微量肉汤稀释法培养基，分别加入不同浓度的药物，37℃恒温培养24小时，观察生长情况，确定最低抑菌浓度。
实验六 金黄色葡萄球菌检验
实验六金黄色葡萄球菌检验（第二篇）1 目的1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法2 原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。
可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。
如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。
这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
3 材料3.1 样品奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。
3.2 菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）3.3 培养基与试剂7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。
3.4 其它显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。
4 流程5 步骤5.1 一般培养称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。
吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。
同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。
置36±1℃温箱培养24h。
5.2 分纯培养将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。
若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。
实验十二金黄色葡萄球菌
致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。
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5
金葡菌镜下特征
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6
操作流程
检样25g(mL) +稀释液225mL，均质
7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
36℃±1 ℃， 18h~24h
Baird-Parker平板，血平板
36℃±1 ℃
B-P平板18h~24h或45h~48h 血平板 18h~24h
涂片染色
观察溶血
BHI肉汤和营养琼脂斜面 血浆凝固酶试验
结果报告
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7
菌落特征
Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色， 周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径 2mm~3mm。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典 型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干 燥。
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23
取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中， 再加入 BHI培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇 匀，置 36 ±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时 观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管 倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原 体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆 凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培 养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明 书操作，进行血浆凝固酶试验。
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3
生化特性
典型的金葡菌呈球形，大小0.5×1.0μm。致病 性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长， 常呈双球菌或短链状排列。
本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰 氏染色阳性。
金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为 5%～7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制 杂菌。
金黄色葡萄球菌检验
金黄色葡萄球菌检验1. 概述金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的细菌，广泛存在于自然环境和人体皮肤表面。
虽然大多数的金黄色葡萄球菌对人体无害，但一些菌株具有致病性，可以引起多种感染，包括皮肤感染、肺炎、血流感染等。
因此，对金黄色葡萄球菌的检验具有重要意义，能及早发现和控制感染的传播。
本文将介绍金黄色葡萄球菌检验的一些常用方法和技术。
2. 菌种的采集和处理2.1 采集样本金黄色葡萄球菌通常从病人的感染部位或者其他潜在的感染源采集样本。
常见的样本类型包括：皮肤切口分泌物、鼻拭子、血液、尿液等。
2.2 样本处理在进行金黄色葡萄球菌的检验之前，需要对采集的样本进行适当的处理。
处理方法取决于样本的类型和检验的目的。
常见的处理步骤包括：•鼻拭子：将鼻拭子放置在含有缓冲液的管中，将管子旋紧，并轻轻摇动一段时间，使细菌尽可能地释放到缓冲液中。
•血液：采集静脉血样本，将血液转移到无菌包装的管中，并立即将管子送到实验室进行处理。
•皮肤分泌物：使用无菌棉签或拭子采集患者分泌物，放入管中并送到实验室。
3. 常用的金黄色葡萄球菌检验方法3.1 培养方法金黄色葡萄球菌通常通过培养方法来进行检验。
常用的培养基包括牛肉肝脏套，Columbia血琼脂和Mannitol盐琼脂。
在封闭器具中加热灭菌后，将菌种均匀涂布于培养基上，并在适宜的温度（通常为37摄氏度）下孵育24-48小时，观察是否有金黄色小圆菌落的形成。
3.2 利用PCR技术检测PCR（聚合酶链式反应）是一种敏感且快速的方法，可以检测金黄色葡萄球菌的DNA。
通过PCR技术，可以快速鉴定金黄色葡萄球菌的存在和菌株的特性。
这种方法特别适用于高致病性金黄色葡萄球菌的检测。
3.3 人类源金黄色葡萄球菌的毒力基因检测金黄色葡萄球菌通常通过其特有的毒力基因来引起感染。
通过PCR技术，可以检测和鉴定菌株中的毒力基因。
常见的毒力基因包括PVL、TSST-1、ETA等。
金黄色葡萄球菌的致病性及检测技术
金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温 度37°C，最适生长pH7.4，干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起， 直径0.5~1.0mm。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物、青霉素、红霉素、土霉素、新霉素等 抗生素敏感，但易产生耐药性，对碱性染料敏感。
1、玻片法：将待试菌落乳化于玻片上的盐水中，经10~20S证实无自凝后，用接种环取人或 兔血浆一环，与乳化菌液混合，出现凝集者为阳性，另设生理盐水为阴性对照。 2、试管法：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀， 置37℃培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时， 内容物不流动，判为阳性。
生化鉴定 如上述，注意与其他凝固酶阳性的葡萄球菌的鉴别要点：PYR（吡咯烷酮-β-萘基酰胺 试验阴性；VP试验阳性；鸟氨酸脱羧酶试验阴性。 免疫学方法 用酶联免疫吸附试验和对流免疫电泳方法可检测金葡菌的磷壁酸抗体。
分子生物学方法
包括PFGE脉冲场凝胶电泳以及酶切图谱分析等。
定量检测方法
目前关于食品中金黄色葡萄球菌的定量检测方法主要有Baird-Parker平板计数法、显色培养 基计数法、Petrifilm TM 测试片计数法、MPN计数法、酶联免疫吸附法、反相被动乳胶凝 集法、放射免疫测量法、反相血凝实验、纤维玻片凝胶双扩散法、聚合酶链式反应技术等。
此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
检测与诊断
标本采集
采自不同感染部位的各种标本，包括血液、脑脊液、穿刺液；痰液、脓液、创伤分 泌物、尿液、粪便和呕吐物等。
直接涂片镜检
直接涂片检查在正常情况下呈无菌状态的体液标本如血液、脑脊液、穿刺液等，若有 检出革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列、无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm的球菌。即具有 重要的临床价值。
金黄色葡萄球菌
1.血浆凝固酶试验：原理:金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝集颗粒；游离型的血浆凝固酶则可使试管中血浆发生凝固。
大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而非致病株一般不产生。
因此，血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。
葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种是结合凝固酶（用玻片法测试），另一种是游离凝固酶（用试管法检测）。
方法：（1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9g／L氯化钠(生理盐水)溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10～20s内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。
（如出现颗粒状凝集现象即为阳性。
如不立即发生凝集，可稍待一，二分钟，并轻轻摇动玻片，加速反应，若无凝集时则为阴性。
）（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0．5ml于试管再加0.5ml 待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。
），混匀后置37℃水浴中，每30min 观察1次结果。
若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性。
（观察结果，将试管微微倾斜，血浆成冻胶样凝块者为阳性，血浆仍为液状者为阴性。
）【结果判断】（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。
（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。
4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。
【注意事项】（1）最好使用EDTA抗凝的兔血浆，因为如果使用枸缘酸盐抗凝血浆会产生假阳性结果（2）玻片法：10秒内观察结果，如超过10 秒可出现假阳性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。
2. 耐热核酸酶试验原理：致病性葡萄球菌能产生一种耐热核酸酶，它能分解DNA，使含甲苯胺蓝核酸琼脂显示粉红色玻片法：取融化好的甲苯胺蓝DNA琼脂3ml均匀浇在载玻片上，待琼脂凝固后打上6-8个孔径为2-5mm的小孔，各孔分别加一滴经沸水浴3分钟处理过的待检葡萄球菌和阳性阴性对照葡萄球菌培养物，35℃大气环境孵育3小时，观察有无粉红色圈及其大小。
金黄色葡萄球菌的检验
金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)一．金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。
普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。
二、培养基7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。
三、金黄色葡萄球菌的定性检测主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。
1.样品的处理和增殖培养：样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。
（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。
金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。
3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。
（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。
金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。
微生物检测技术-金黄色葡萄球菌检测
国内检测标准
GB 4789.10-2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
GB/T 20944.32008
食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素的测定 第3部分：黄曲霉毒素 M1的测定
GB/T 23511.42008
食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定 第4部分：脱氢乙酸含量的 测定
样品中的快速检测。
纳米技术
纳米材料如纳米金、纳米孔等在 金黄色葡萄球菌检测中展现出巨 大潜力，具有高灵敏度、低检测
限和快速响应等优点。
未来研究方向
开发更高效、特异性的检测方法
01
针对金黄色葡萄球菌的不同表型和基因型，开发更高效、特异
性的检测方法，提高检测的准确性和可靠性。
集成化与自动化
02
将多种检测方法集成于一体，实现金黄色葡萄球菌的自动化检
治疗方案的选择。同时，对于流行病学调查和疾病监测也具有重要意义。
05
CATALOGUE
金黄色葡萄球菌检测技术展望
新技术发展与应用
基因组学技术
利用全基因组测序技术，能够快 速准确地检测金黄色葡萄球菌，
并识别其耐药性和毒力基因。
生物传感器技术
生物传感器能够实时、快速地检 测金黄色葡萄球菌，具有高灵敏 度和特异性，适用于食品和环境
测，提高检测效率，降低人工误差。
多重耐药性研究
03
深入研究金黄色葡萄球菌的多重耐药性机制，为遏制耐药性的
传播提供科学依据和技术支持。
对公共卫生的影响与意义
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，通过改进检测技 术，能够及时发现和控制食品中的污染，保障公众的食品 安全。
预防疾病传播
金黄色葡萄球菌
葡萄球菌感染创口的革兰氏染色涂片
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和 侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小 板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使 血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核 酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎 的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。
比如：美国3M公司生产的金黄色葡萄球菌快速检测试片， 可以直接计数产生耐热核酸酶的金黄色葡萄球菌，操作简单， 缩短了时间。
金黄色葡萄球菌污染的控制
防止金黄色葡萄球菌污染食品 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进 行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上 呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要 暂时停止其工作或调换岗位。 防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定 期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出 后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品 要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。 对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病 变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。
金黄色葡萄球菌的抗原构造及分型简介
对分型进行简单的了解 １、血清学分型： 金葡水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。 蛋白抗原是凝集抗原，无特异性。 多糖抗原有特异性。 绝大多数金葡含有A型抗原，B型抗原主要存在于凝固酶阴 性菌株，C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。 ２、噬菌体分型： ３、根据肠毒素分型： ４、根据血浆凝固酶分型：
食品中金黄色葡萄球菌检验
食品中金黄色葡萄球菌检验（一）原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。
此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在食品中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。
因此，检验食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热性的DNA 酶。
（二）仪器和设备（1）显微镜（2）培养箱：（36±1）℃（3）离心机（4）灭菌吸管：1mL、10mL（5）灭菌小试管（6）培养皿：皿底直径9cm（7）均质机（8）载玻片（10）酒精灯（11）水浴锅（三）培养基和试剂（1）胰酪胨大豆肉汤培养基成分：胰酪胨（或胰蛋白胨）17g 磷酸氢二钾 2.5g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g 葡萄糖 2.5 g氯化钠100g 蒸馏水1000mL 制法：将上述各成分混合，加热时轻轻搅拌使之溶解，分装三角瓶后，于121℃下高压灭菌15min。
最终pH为7.3±0.2。
（2）7.5%的氯化钠肉汤培养基成分：蛋白胨10g 蒸馏水1000mL 牛肉膏3g pH=7.4 氯化钠75g 制法：将上述各成分加热溶解，校正pH，分装于三角瓶中，在121℃下高压灭菌15min。
（3）黄豆粉浸液取黄豆粉5g、氯化钠10g，加入蒸馏水100mL。
置100℃水浴内加热1h，放于冰箱中过夜。
吸取上清液即为黄豆浸液。
（4）牛肉消化汤成分：绞碎牛肉1000g 15%氢氧化钠溶液27mL胰蛋白酶40mL 三氯甲烷1mL氯化钠10g 蒸馏水2000mL 制法：①称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热到80℃，维持15min。
②加氢氧化钠溶液，pH试纸呈弱碱性，冷至40℃。
金黄色葡萄球菌检验与计数,GB4789.10-2016及纸片法-JW
金黄色葡萄球菌的肠毒素
金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一 种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因 为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大 量肠毒素而导致的。
近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株 在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能 产生两种或两种以上的肠毒素。
肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的 肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水， 难溶于有机溶剂。
分离培养基
Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚 碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能 促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色 和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也 能促进金黄色葡萄球菌的生长。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑 凸起、湿润，直径约2~3mm，颜色呈灰色到 黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在 其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似 有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和 透明圈的非典型菌落。
血浆凝固酶试验
挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落 1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂 小斜面，36℃±1℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再 加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL～0.3mL，振 荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半 小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将 试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积 大于原体积的一半，判定为阳性结果。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色， 有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、 表面光滑，周围有透明的β溶血环。
血平皿上的形态
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素， 因此在血平板上产生明显的溶血环。
典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而 突起，圆形，不透明，表面光滑，菌落周围 有完全透明溶血环。
金葡鉴定生化实验
金葡鉴定生化实验金葡鉴定生化实验是用于鉴定金黄色葡萄球菌的一种生化试验。
该实验通过观察细菌对各种生化试剂的反应来判断其是否为金黄色葡萄球菌。
具体步骤如下：1.将可疑菌株接种于营养琼脂平板上，培养18-24小时。
2.取可疑菌落进行涂片、染色、镜检，观察菌落形态和染色特性。
3.对可疑菌落进行生化试验，包括甘露醇发酵试验、耐热核酸酶试验、血浆凝固酶试验等。
4.根据生化试验结果，结合菌落形态和染色特性，判断是否为金黄色葡萄球菌。
其中，甘露醇发酵试验是金葡鉴定生化实验的一种，阳性结果可以辅助诊断金黄色葡萄球菌。
此外，血浆凝固酶试验也是检测金黄色葡萄球菌是否具有致病性的常用试验。
需要注意的是，生化试验的结果需要结合其他实验室检查结果和患者的临床表现进行综合分析，以确定最终的诊断。
"金葡"可能是指"金葡菌"（Candidaauris）或其他相关的生物体。
如果你需要进行生化实验来鉴定金葡或其他微生物，通常需要使用特定的实验方法和培养基。
以下是一般性的生化实验，用于鉴定金葡或其他酵母菌：格拉姆染色法（GramStaining）：格拉姆染色是一种最基本的微生物分类方法。
金葡是一种真菌，通常是革兰氏染色阴性的。
氧气需求实验：金葡是一种真菌，通常是好氧菌（需氧生长）。
在含有氧气的条件下培养金葡，可以观察其生长状况。
生化反应培养基：使用含有特定生化反应底物的培养基，观察金葡对这些底物的反应。
例如，利用含有葡萄糖、果糖等碳源的培养基，观察其在不同底物上的发酵反应。
形态学观察：观察金葡在培养基上的生长形态，包括菌丝、孢子的形成等。
生物化学检测：使用生化试剂，检测金葡的代谢产物，如酶的产生等。
请注意，具体的实验方法和培养条件可能因金葡的不同类型而异。
对于金葡菌等致病性真菌，确保在受过专业培训的实验室环境中进行相关实验，并遵循相应的生物安全规范。
最好的做法是在专业实验室中进行这些实验，或者请教专业微生物学家的帮助。
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析
按照现行的国标方法，金黄色葡萄球菌检测方法分为第一法定性检验、第二法平板计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品），以及第三法M P N 计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品）。
第一法定性检验过程包括样品处理、样品增菌、平板分离划线、初步鉴定、确证鉴定这5个步骤，整个流程全部完成至少需要5天时间。
第二法平板计数法包括5个步骤——样品稀释、样品接种涂布、典型菌和可疑菌计数、鉴定试验、结果计算，整个流程全部完成至少需要4天时间。
第三法M P N 计数法同样包括5个步骤，即样品稀释、样品增菌、平板分离划线、鉴定试验、查MPN 表确认结果，整个流程全部完成至少需要5天时间。
以下将对金黄色葡萄球菌的检测流程进行简单介绍，并对难点、注意事项进行梳理和讲解。
1 第一法：金黄色葡萄球菌定性1.1 样品处理固态和半固态样品：称取25g样品至盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤中，充分混匀。
液体样品：吸取25m L 样品至盛有225m L 7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。
1.2 样品增菌将上述样品匀液置于金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析□ 李留洋 锐德检测技术（天津）有限公司重的感染。
该菌对营养的要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧。
容易受金黄色葡萄球菌污染的食品主要为乳制品、蛋及蛋制品、各类熟肉制品，其次是含有乳类的冷冻食品等，因此对于该菌的检验也被确定为食品致病性菌种检验中的重要项目。
图1 样品处理36±1℃的恒温培养箱中培养18~24h 。
1.3 平板分离划线该步骤是整个金黄色葡萄球菌检测环节中最重要的步骤之一，因为平板划线分离的效果决定了可疑菌落的判定和选择。
平板划线选择三分法或四分法则分离效果较好，更容易出现单菌落平板。
1.4 初步鉴定分离的培养基选用B a i r d -Pa r k e r 平板（B P 平板）和血平板。
结果显示，金黄色葡萄球菌在B a i r d -Pa r k e r 平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，菌落直径为2~3m m ，颜色呈灰黑色至黑色、有光泽，常有浅色（非白色）边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带，当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感；有时可见到不分解脂肪的菌株——除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同；从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其颜色常较典型菌落略浅，且外观可能较为粗糙，质地较干燥。
食品中金黄葡萄球菌及其检验
食品中金黄葡萄球菌及其检验第七章食品中致病球菌的检验第一节金黄葡萄球菌及其检验金黄色葡萄球菌及其检验金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌是该属中的一个种引起人类疾病的葡萄球菌主要是金黄色葡萄球菌,除可引起皮肤组织炎症外,还可产生肠毒素如果该菌在食品中大量生长繁殖,产生毒素,人误食了含有毒素的食品,就会发生食物中毒,因此,由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在威胁,所以检验食品中的金黄葡萄球菌及数量具有实际意义主要内容一、金黄色葡萄球菌的生物学特性二、金黄色葡萄球菌的检验一、金黄色葡萄球菌的生物学特性、形态与染色分型简介、培养特性生化特性毒素与酶抵抗力致病性、形态与染色：(staphylococcusaureus)典型的金黄色葡萄球菌为球型直径μm 左右显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛大多数无荚膜。
革兰氏染色阳性。
典型的金黄色葡萄球菌为球型直径mm左右显微镜下排列成葡萄串状。
葡萄球菌革兰染色镜下图金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片金黄色葡萄球菌的透射电镜照片分型简介血清学分型：金黄色葡萄球菌水解获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原蛋白抗原主要为葡萄球菌A 蛋白（SPA)是一种表面抗原以上金黄色葡萄球菌有此抗原无特异性。
多糖抗原为半抗原有型特异性。
噬菌体分型根据肠毒素分型根据血浆凝固酶分型、培养特性金黄色葡萄球菌营养要求不高在普通培养基上生长良好需氧或兼性厌氧最适生长温度°C,最适生长pH。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性可在NaCl肉汤中生长。
在肉汤培养基中生长迅速℃,培养后h,呈均匀浑浊生长,延长培养时间,管底出现少量沉淀,轻轻振摇,沉淀物上升,旋即消散,培养d后可形成很薄的菌环,在管底则形成多量粘稠沉淀。
、培养特性葡萄球菌在普通营养琼脂平板上培养h后,可形成圆形凸起、边沿整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明的菌落直径mm。
食品中金黄色葡萄球菌检验
式（2）
案例
T A1B1/ C1 A2B2 / C2其中Leabharlann 1.1d样品稀释液
10-1
10-2
典型菌落数
183
21
T：样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
用于做血浆凝固
A1：第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
5
5
酶菌落数
A2：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1：第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数； 血浆凝固酶阳性
二、金黄色葡萄球菌定性检测
注意事项
Baird-Parker平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏:提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素 丙酮酸钠:生长促进剂 亚碲酸盐:对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色 卵黄:提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂:对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。
36±1℃， 24~48h
圆形，光滑突起，湿润，直径23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘 常为淡色（米黄色或灰白色略带 灰色或黄色的白色），周围为一 混浊带，在其外缘常有一透明圈。 用接种针接触菌落似有黄油树胶 的粘稠感。
革兰氏染色
血浆凝固酶鉴别
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球 菌，排列呈葡萄球状，无芽孢
血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大 而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。
36℃±1 ℃
45h~48h
计数及血浆凝固酶试验
GB 4789.10-2016 金黄色葡萄球菌的检验第二法
报告
操作规程
样品稀释 同菌落总数检验
选择合适稀释度 接种涂布BP平板
三、金黄色葡萄球菌定量检测
样品处理
移1ml
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此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
检测与诊断
标本采集
采自不同感染部位的各种标本，包括血液、脑脊液、穿刺液；痰液、脓液、创伤分 泌物、尿液、粪便和呕吐物等。
直接涂片镜检
直接涂片检查在正常情况下呈无菌状态的体液标本如血液、脑脊液、穿刺液等，若有 检出革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列、无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm的球菌。即具有 重要的临床价值。
显色培养基A计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，36℃±1℃培养24 h， 按说明书判读，可疑菌落做补充实验（血浆凝固酶试验，目标菌落血浆凝固酶试验为阳 性）。 显色培养基B计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，36℃±1℃培养24 h， 按说明书判读，可疑菌落做补充实验（滴加1 mol/L盐酸，目标菌落有透明圈）。
鉴别实验
一、血浆凝固酶试验
血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌所产生的，与其致病力有关的一种侵袭性酶，其作用 是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。 血浆凝固酶分为结合型和游离型。前者结合在细菌的细胞壁上，能直接作用于血浆中的 纤维蛋白原，使之转化为纤维蛋白，环绕菌体而形成凝块。而游离型血浆凝固酶则在产 生后被分泌到菌体外，不能直接作用于纤维蛋白原，但可以激活血浆凝血酶原，使之转 化成凝血酶，后者再作用于纤维蛋白原使其转化为纤维蛋白。 具体的测量方法也因此分为玻片法和试管法两种。
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺 血和坏死 b.杀死白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞
c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌 体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关
生化鉴定 如上述，注意与其他凝固酶阳性的葡萄球菌的鉴别要点：PYR（吡咯烷酮-β-萘基酰胺 试验阴性；VP试验阳性；鸟氨酸脱羧酶试验阴性。 免疫学方法 用酶联免疫吸附试验和对流免疫电泳方法可检测金葡菌的磷壁酸抗体。
分子生物学方法
包括PFGE脉冲场凝胶电泳以及酶切图谱分析等。
定量检测方法
目前关于食品中金黄色葡萄球菌的定量检测方法主要有Baird-Parker平板计数法、显色培养 基计数法、Petrifilm TM 测试片计数法、MPN计数法、酶联免疫吸附法、反相被动乳胶凝 集法、放射免疫测量法、反相血凝实验、纤维玻片凝胶双扩散法、聚合酶链式反应技术等。
1、玻片法：将待试菌落乳化于玻片上的盐水中，经10~20S证实无自凝后，用接种环取人或 兔血浆一环，与乳化菌液混合，出现凝集者为阳性，另设生理盐水为阴性对照。 2、试管法：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀， 置37℃培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时， 内容物不流动，判为阳性。
金黄色葡萄球菌的致 病性检测技术
2016/6/16
简介
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属 （Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌，可引起许多严重感染。
金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温 度37°C，最适生长pH7.4，干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起， 直径0.5~1.0mm。
分离培养 可以选用普通营养琼脂平板、血平板和高盐甘露醇平板，血平板用葡萄糖肉汤增菌培 养基。该菌在普通肉汤中呈均匀迅速混浊生长；若接种于琼脂平板上35℃过夜后可形成直 径约2~3mm的厚菌落、湿润有光泽、呈金黄色不透明圆形凸起。若接种于血平板，菌落周 围可形成明显的透明的β—溶血环。在高甘露醇平板上金黄色葡萄球菌生成淡橙黄色菌落， 以此可与其他凝固酶阴性的葡萄球菌相鉴别。
二、耐热核酸酶试验 将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，35℃培养 24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。 三、甘露醇发酵实验 金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇。
四、Staphaurex 胶乳凝集实验
是鉴定金黄色葡萄球菌的一种快速、简便的商品化直接凝集试验。其基本原理是在纸片上 滴加包被有纤维蛋白原和IgG抗体的聚苯乙烯胶乳，然后用接种环挑取待鉴定菌株的新鲜培 养物加入混匀，若出现凝集块现象即为阳性。
金黄色葡萄球菌流行病一般多见于春夏季。
中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中 毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为 污染源。 金黄色葡萄球菌可引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒 症等全身感染。 金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生毒素，对肠道破坏性大，金黄色葡萄球菌肠炎起病 急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。
Petrifilm TM 测试片计数法：稀释好的菌液1 mL接入测试片，静置测试片1 min，36℃±1℃ 培养24 h，按说明书判读，必要时对可疑菌落用确认反应片做补充实验。
金黄色葡萄球菌在显色培养基A上的生长率最高，PetrifilmTM测试片的选择性最强，4种计 数方法的检出限相当，检出结果与实际含菌量无显著差异。结论：选择显色培养基作为日 常检验的辅助手段可大大提高检测灵敏度、缩短检验周期、节约检验成本，值得在日常检 验中推广应用。
d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据 鉴定金黄色葡萄球菌 e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C1、 C2、C3、D、E及F八种血清型。肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食 物中毒症状是呕吐和腹泻。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物、青霉素、红霉素、土霉素、新霉素等 抗生素敏感，但易产生耐药性，对碱性染料敏感。
流行病学
美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物 中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则占到45%。中国金黄色葡萄球菌引起的食 物中毒事件也时有发生。 2002年，澳大利亚一次公众活动因前一天准备的食物贮存不当导致250人出现恶心、呕吐、 胃痉挛的症状，其中100多人因为脱水需要进医院治疗。 2001年4月12日，无锡市锡山区 所辖小学、幼儿园因课间加餐饮用袋装牛奶饮料导致食物中毒事件。 2000年6月底到7月 中，日本有14555人被感染，感染源来自日本当时最大的牛奶生产商雪印乳业。1997年， 美国佛罗里达31人食用被污染的火腿片被感染，症状持续了大约24小时。