【大学课件】特殊变异菌的筛选方法
菌种筛选方法
菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。
初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。
因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。
初筛的手段应尽可能快速、简单。
复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。
1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。
尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。
当然，这种鉴别方法只能用于初筛。
有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。
又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。
1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。
从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。
指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。
2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。
如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。
菌种筛选方法PPT课件
2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、 生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及 其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳 定性及遗传操作的难易程度等。
3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。
第14页/共197页
三、将生态学方法用于培养分离的一般思路要 点
• 1．罗列出所要分离的微生物类群； • 2．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要
第23页/共197页
(二)生态学参数及培养基 的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环 境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本 的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量 和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必 须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中 的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、 氮源，如几丁质、纤维素或果胶。
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层 顺序采集；
• 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆 筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～ 15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或 玻璃瓶中。
• 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢 慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min， 洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下 根部残留的土，这部分即为根际土样。
• 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土 样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑 料袋和塑料瓶等。
第18页/共197页
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集
日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为
筛选菌种的四个步骤
筛选菌种的四个步骤筛选菌种是指通过一系列实验和评估来确定最适合特定应用的微生物菌株。
下面将介绍筛选菌种的四个步骤：1.初始筛选：2.生物活性筛选：在生物活性筛选阶段，我们通过对菌株的生物活性进行评估来确定其具有潜在用途的能力。
这通常包括筛选抗生素产生菌、产酶菌株等。
首先进行抗菌活性筛选，将菌株培养在富含病原菌的琼脂平板上，观察是否有抗菌圈产生。
然后，进行产酶筛选，比如进行淀粉酶、纤维素酶等酶的产生能力的评估。
此外，还可以通过对菌株的生态学行为、对有毒物质的降解能力等进行评估。
3.遗传特性筛选：在遗传特性筛选阶段，我们关注的是菌株的遗传特征。
这通常包括筛选具有高产能、稳定性和耐受性等特性的菌株。
这一步骤通常涉及菌株的基因分析，如PCR、序列测定等。
通过对菌株的基因组和基因表达数据进行分析，我们可以确定菌株的基因组组成、功能基因和代谢途径等。
此外，还可以使用基因工程技术来改良菌株的特性，例如通过基因突变或基因组互换等。
4.应用评估：应用评估是最后一步，用来评估菌株在特定应用中的实际效果。
这个步骤通常包括菌株的生物质量产量、产物纯度和质量等因素的评估。
此外，还可以考虑菌株的生长特性、代谢路径和产物稳定性等。
通过与已经商业化或研究中的菌株进行比较，可以确定最具潜力的菌株，并进一步开发应用。
总结起来，筛选菌种的四个步骤包括初始筛选、生物活性筛选、遗传特性筛选以及应用评估。
这四个步骤通过从原始样品中筛选出具有潜在应用的微生物菌株，并对其进行评估，以确定最适合特定应用的菌株。
这些步骤的目的是发现具有特殊功能的微生物菌株，并利用它们在农业、医药、环境等领域的广泛应用。
菌种的筛选方法及步骤(二)
菌种的筛选方法及步骤（二）引言：菌种的筛选是微生物学研究中的重要环节之一，它可以帮助科研人员确定具有理想特性和功能的微生物菌株。
本文将继续介绍关于菌种筛选的方法和步骤，以帮助读者更好地理解和应用。
概述：菌种筛选是通过一系列实验步骤来评估和选择微生物菌株的过程。
这些步骤包括初步的预筛选、进一步的生理特性和功能评估、细胞分析以及最终的筛选和鉴定。
正文内容：一、初步的预筛选1.核酸检测：使用PCR技术对菌株进行DNA提取和扩增，通过与目标靶标的比对来初步筛选具有相关基因组的菌株。
2.形态学和生理特性观察：通过显微镜观察菌株的形态特征，并进行一系列生理特性的初步评估，如生长速度、耐受性等。
二、进一步的生理特性和功能评估1.生长优势评估：在不同培养条件下比较菌株的生长速度和优势，以确定最适宜的培养条件。
2.代谢特性评估：通过测定菌株对特定有机物的降解能力和产生的代谢产物来评估其代谢特性。
3.生物活性评估：测定菌株对不同病原微生物的抑制活性，评估其潜在的生物控制能力。
4.耐受性评估：将菌株暴露在不同的胁迫条件下，如高温、低温、酸碱等，评估其对环境胁迫的耐受能力。
三、细胞分析1.细胞形态观察：通过扫描电镜和透射电镜观察菌株的细胞形态结构。
2.细胞代谢产物分析：使用色谱质谱等技术对菌株的代谢产物进行定性和定量分析，以了解其代谢能力。
四、最终的筛选和鉴定1.生物学特性分析：通过菌株的生长特性、生理学、遗传学等方面的综合分析，确定其是否具备所需的特性。
2.16SrRNA鉴定：通过比对菌株的16SrRNA序列和已知菌株的数据库，进行菌株的分类和鉴定。
总结：菌种的筛选是一个复杂的过程，需要利用多种方法和步骤来评估和选择最合适的菌株。
初步的预筛选可以帮助缩小范围，进一步的生理特性和功能评估可以深入了解菌株的能力。
细胞分析可以提供对菌株的细胞结构和代谢能力的了解，最终的筛选和鉴定可以确定菌株的分类和特性。
通过这些方法和步骤，科研人员可以获得高质量的菌株，为微生物学研究和应用提供坚实的基础。
突变株筛选
（六）测定生长谱 1.制备MM平板 在培养皿底部划分5个区域，做好标记 2.将可能是营养缺陷型的菌株，制备菌悬液，接 种于平板上。 3.在相应的区域加入不同的氨基酸组，进行培养。
（七）鉴定缺陷型 观察菌的生长情况，确定氨基酸缺陷型。 1 组氨酸 苏氨酸 谷氨酸 组 2 3 别 4 6 天冬 氨酸 亮氨酸 甘氨酸
营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变丧失了合成某些代谢产物如氨基酸核酸碱基维生素的能力必须在基本培养基中补充该种营养成分才能正常生长的一类突变株
实验三 氨基酸营养缺陷型突变 株的筛选
一、目的要求 目的要求
• • 了解营养缺陷型突变株选育的原理。 学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的 诱变、筛选与鉴定方法。
二、基本原理
• 营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素 或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些 酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如 氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在 基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生 长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消 除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制 或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途 径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中 已广泛使用营养缺陷型菌株。
五、结果与讨论
1、结合实验讨论影印法应用的局限性。 2、思考实验中出现的问题，今后将如何避 免？
（四）涂CM（complete medium)平皿、培养突 变型 • 1.倒CM平板：(实验二中已完成） 。 • 2.稀释和涂CM平皿：(实验二中已完成）
（五）检出缺陷型 • 1.倒CM、MM（minimum medium）平板： 融化CM、MM培养基，各制备一个平板。 在平板下贴好画有20个小格的纸。 • 2.用逐个检出法检测 用牙签挑取20个长势 良好的菌落，先接在 MM培养基的一个位 点上，再接CM培养 基的相应位点上。 32度培养48小时。
突变体的筛选和应用
突变体的筛选和应用突变体是指生物体在自然或人工环境下发生基因突变所产生的个体，由于其基因组的改变，使得其在生理、形态、生长发育、代谢等方面与野生型存在差异。
突变体主要分为自然突变和人工诱导突变两种形式，其中人工诱导突变是目前突变体筛选与应用的主要手段之一。
一、突变体的筛选方法突变体的筛选一般分为自然筛选和人工筛选两种方式。
1.自然筛选自然筛选是指通过自我繁殖，筛选出能够适应环境的突变体。
自然筛选一般应用于微生物的突变体筛选，如霉菌、酵母等。
其优点是简单易行且成本低廉，但筛选效率较低。
2.人工筛选人工筛选是指通过人工的方法在适宜的环境下筛选出具有特殊性状的突变体。
人工筛选一般应用于植物、动物突变体筛选。
其优点是筛选效率高、筛选结果确定性好，但实验周期长、人工干预多。
二、突变体的应用突变体的应用主要包括以下几个方面：1.基因功能分析由于突变体具有与野生型差异的特殊性状，因此可用于分析基因在生物体中的作用机制。
一种常用的方法是比较突变体与野生型在形态、生理等方面的差异，进而确定与该特殊性状相关的基因，从而揭示其作用机制。
2.遗传育种突变体可用于遗传育种，如植物的突变体可用于选育出具有特殊性状的新品种。
例如，矮杆性突变体被广泛应用于谷物、蔬菜、果树等的改良。
3.生物制品生产突变体可用于生物制品的生产。
由于突变体在代谢途径等方面差异较大，因此可用于生物制品的生产。
常见的利用突变体生产生物制品，如酶、抗体、工业化酵母等。
4.环境修复突变体可用于环境修复。
例如，通过选育耐盐性、耐寒性突变体，可用于盐碱地改良和高寒地区耕作的开发。
三、总结突变体的筛选与应用对生物学研究和产业发展具有重要价值。
随着人工诱导突变技术的不断推进和基因编辑技术的应用，突变体筛选和应用的广度和深度还将不断扩展。
产量突变株的筛选
2.诱变育种的步骤
出发菌株
纯化，同步培养
挑变异菌于斜面培养基上
培养液
离心收集细胞、洗涤，制 菌 悬液，玻璃珠打散，过 滤
初筛
性能粗测
单个细胞或孢子悬液
活菌计数，诱预备试验
复筛
性能精测
诱变剂处理
存活细胞计数，计算致死 率 变异率计算
菌种保藏及扩大试验
平板分离
菌种用于生产，并进行保藏
卡介苗： 牛型结核杆菌 –牛胆汁、甘油、马铃薯培养基—移种230代（13年） 显著减毒结核杆菌(即卡介苗)
(二)诱变育种
利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因 的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所 需要的高产优质力株。 一般通过营养缺陷型突变株、抗阻遏和抗反 馈突变型、抗性突变型（抗生素抗性突变株、 条件抗性突变株）来筛选。
营养缺陷型诱变筛选步骤及方法
诱变处理
营养缺陷型的浓缩
营养缺陷型的检出
营养缺陷型的鉴定
缺陷型的浓缩 ①抗生素法
原理：青霉素、制 霉菌素等抗生素作 用于正常生长着的 野生型微生物细胞， 而对处于休止态的 营养缺陷型细胞无 作用。 方法：将菌培养在 含抗生素的MM基中
②菌丝过滤法
适用于：丝状（放线 菌、霉菌） 原理：基本培养基上 只有野生型孢子发育 成菌丝；auxo孢子可 通过滤膜，野生型菌 丝不能通过。
3. 三类突变株的筛选
（1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选
产量突变株的筛选
琼 脂 块 培 养 法
抗药性突变株的筛选
方法：梯度平板法（gradient plate）
用梯度平板法筛选抗代谢拮抗物突变朱
举例说明组成型突变菌株的筛选方法
举例说明组成型突变菌株的筛选方法恒化器法
常被用于微生物的“驯化”。
在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。
为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。
随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。
循环培养法
利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替
循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。
当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。
将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步,组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。
初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。
因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。
初筛的手段应尽可能快速、简单。
复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。
1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。
尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。
当然，这种鉴别方法只能用于初筛。
有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。
又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。
2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。
具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。
这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。
它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。
图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ppt课件
6
★与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基
基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株 营养要求的最低成分的合成培养基。
完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌 株生长的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地加 入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型 菌株生长的合成培养基。
在富含生物素的培养基中进行发酵时： 先在30℃（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，
适当时间后提高温度（ 40℃ ，非允许条件），即能获 得谷氨酸的过量生产。
ppt课件
3
4.3.2抗药性突变株的筛选
方法：梯度平板法（gradient plate）
抗药性突变株的应用：
作为菌株的遗传标记
作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）
ppt课件
4
4.3.3抗生素抗性变异株的筛选：
ppt课件
5
4.3.4 营养缺陷型(auxotroph)的筛选
★与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：
营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必 须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌 株。如：lys -， bio-
野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷 突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ;
原理：基本培养基上只有发 育成菌丝；auxo孢子可通 过滤膜，野生型菌丝不能通 过。
ppt课件
10
缺陷型的检出：
①逐个检出法：
ppt课件
11
②影印平板培养法
ppt课件
12
③夹层培养法
ppt课件
13
缺陷型的鉴定：
①生长谱法
• 方法简便； • 回变和污染不影响 结果 • 测定物质可为粉末 或纸片
4.3 特殊变异菌的筛选方法：
ppt课件
1
4.3.1条件抗性突变型的筛选
以温度敏感突变为例：
筛选方法：
用途：常用于提高代谢物产量
原因：是由于某一酶蛋白结构 改变后，在高温下活力丧失
重要性：如果此酶为蛋白质、 核酸合成途径中所需的酶，则 此变异株在高温下的表型就是 营养缺陷型。
ppt课件
2
举例： 由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理 得到温度敏感变异株Ts88: 30℃培养时能正常生长 40℃是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷 氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。
ppt课件
16
②组合补充培养基法：
–将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的 缺陷类型，或快速分离出所需缺陷类型的菌株。
C B
D E
A
F
H
G
ppt课件
17
★缺陷型的应用
▪ 作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变 育种、
研究代谢过程时用作亲本标记；
▪作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种； ▪作为aa、维生素、碱基的测定菌株。
ppt课件
18
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做Байду номын сангаас更好！
测定一般应分两阶段：
➢ 第一阶段：测定是哪类物质的缺陷 型；
➢ 第二节段：根据第一阶段确定的范 围，进一步确定是哪种具体化合物 的缺陷型；
ppt课件
14
组合营养物法： 步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：
a. 将多种营养因子编组；
b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；
c. 结果分析；
营养因子分组编排时注意；
ppt课件
7
★营养缺陷型诱变筛选步骤及方法
诱变处理
auxo的浓缩 auxo的检出
auxo的鉴定
ppt课件
8
缺陷型的浓缩：
①抗生素法
原理： 青霉素、制霉 菌素等抗生素作用于生 长着的微生物细胞，对 休止态细胞无作用。
方法：将菌培养在含抗 生素的MM基中
ppt课件
9
②菌丝过滤法
适用于：丝状（放线菌、霉 菌）
1）每组内无重复的营
如： 一组：1 2 3 4 5 养因子 二组：2 6 7 8 9 2）每组中应包含只出 三组：3 7 10 11 12 现一次的因子 四组：4 8 11 13 14 3）每组中其他因子应
五组：5 9 12 14 15 分别出现二次
ppt课件
15
一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15