第五章 基因结构和表达变化
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直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA 形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单 链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生 与相应同源双链DNA不同的迁移率。
检测缺失突变只适于200-300bp长度片段,
且不能确定位置,检出率只有80%.
化学切割错配法 （Chemical cleavage of mismatch, CCM）
抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH)
• 原理
SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基
因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA 退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA， 使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内 退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反 向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作 为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段 的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。
• 同义突变(same sense mutation)： 密码子发生改变, 但所编码的氨基
酸不变。 例如：CUU CUC CUG → 亮氨酸
• 错义突变（missense mutation） 指DNA分子中碱基的取代，经转录产生的 mRNA后，相应密码子发生改变，编码另一种氨 基酸，使蛋白质中的氨基酸组成和排列顺序发生 改变。
构与表达的改变是疾病发生发展的重要机制。
第一节 不同基因通过不同机制导致疾病发生
蛋白质功能紊乱是疾病发生的基因病理机制，但
不同的基因通过不同机制引起蛋白质功能紊乱。 基因结构改变
环境因素影响了基因的表达
外源致病基因的进入表达：产生了毒性蛋白；产 生了合成非蛋白毒性物
质的酶。
3
一、基因结构改变导致蛋白质结构或
核糖核酸酶切分析（RNase cleavage） 缺点：
• 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸
酶切割效率低甚至不切割；
• 分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时
分析DNA的两条链，突变检出率为 70%；
• 需要制备特异性的RNA探针
杂合双链分析法 （heteroduplex analgsis, HA）
原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行 扩增。
3’端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结 构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的 排列组合：
根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就 将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两 个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN 表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的 任一种。这种引物称锚定引物。
4. 倒位是一段核苷酸序列方向倒转
基因突变还分为配子突变与体细胞突变
动态突变指串联重复序列（拷贝数）随世代的传
递而改变。
基因突变的类型
1. 点突变:单个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上，一种碱基 被另一种碱基取代。
分为：
转换 （transition） 颠换 （来自百度文库ransversion）
基因突变的类型
酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage )
• 酶促切割错配是一种与Rnase酶切分析相类似的 方法. • 不同之处是该方法采用的酶是T4核酸内切酶Ⅶ 能够识别12种错配的碱基,并在错配碱基附近进 行酶切. 优点: 对检测DNA片段可用DNA探针杂交检测. 最长检测长度达到1.5Kb. 缺点: 可出现非特异性切割,对错配认别也不是100%.
5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机 引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些 分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点 上。
用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可 获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找 更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以 及尽可能多的5’随机引物。
化学切割错配、酶促切割错配 2．基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析 3．通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、 反义技术、基因诱导超表达
核糖核酸酶切分析
基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA： RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核 糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶 电泳分析酶切片段的大小，即可确定错 配的位置。
方法
• 提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经
识别 4 碱基的限制性内切酶切割 • 实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头 • 进行2轮差减杂交和抑制性PCR • 获得富集的目的基因
第五章
基因结构和表达变化 与疾病的关系
基因结构与表达异常与疾病
• 蛋白质是生命的物质基础，人体各种生命现象 和生命过程主要是通过蛋白质的生理功能体现。
• 疾病的本质是由各种原因引起蛋白质的质和量
的改变的导致的蛋白质空间结构的紊乱。
• 蛋白质的质和量的改变从分子生物学角度讲，
又是基因结构及表达的改变的结果，故基因结
基因突变发生在 hnRNA 的一级结 构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最 终产生异常的蛋白表达产物，改变生 物性状。
(三) 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病
1. 血红蛋白病 (hemoglobinopathy)：
• 血红蛋白(hemoglobin, Hb)的结构特点 • 珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达
人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌 信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基 因表达也受到细胞间信号的调控。通过细胞间信 号传递，能保证基因表达的时间特异性和空间特 异性以及表达水平正常。 • AFP 是胚胎发育过程中表达的蛋白，具有免疫抑 制作用，保护胎儿免受母体免疫攻击。在接受异 常的细胞增殖信号作用下，其基因表达，导致肝 癌细胞逃避机体免疫监视。成为肝癌发生的重要 因素。
• 抑制性差减杂交 (SSH) --- Diatchenko L,
et al. PNAS 1996; 93:6025-6030 • Suppression subtractive hybridization:
a method for generating differentially
regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries
(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应
(1)基因突变引起遗传密码的改变：根据基因 突变产生的遗传效应不同分为
a. 同义突变 (consense mutation)
b. 错义突变 (missense mutation)
c. 无义突变 (nonsense mutation)
d. 移码突变（frame-shifting mutation）
无义突变：
由于碱基的取代、缺失或插入，使原来编 码某种氨基酸的密码子变成一个终止密码子的 基因突变叫无义突变 (nonsense mutation) 。
•酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后 翻译便到此停止。 •亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化 就会成为（终止密码子）UAA。
RFLP--Restriction Fragment Length Polyhmorphism
RFLPs
Microsatellite repeats
二、通过基因表达水平分析确定 基因在疾病发生中作用
• 人类疾病发生的另一个重要原因是基因表达水平的改变， 因基因表达水平的改变涉及的往往不是单一基因，而是多 基因，即一些基因表达增加，一些基因表达降低，导致由 其编码蛋白组成的代谢及调节系统异常，引发疾病。 • 因此通过基因水平找到正常与疾病状态下的差异表达基因，
量变化引起疾病
由于体内外各种因素改变了某基因特定的
DNA序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一 级结构发生改变，改变了基因结构即基因突 变。其分子机制可以是替换、插入或缺失， 因而产生不同的突变类型。
(一) 基因突变的多种类型
1. 点突变是单个碱基的改变：转换和颠换 2. 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 3. 插入是一个或多个核苷酸的增加
三、细胞内因素导致基因表达异常引起疾病
• 异常的细胞内信号导致基因表达异常引起 疾病
高血糖 → DAG↑ → ⊕PKC → ⊕ ACE → AngⅡ ↑
刺激蛋白质合成 心肌肥大
异常的DNA甲基化导致基因表达异常引起疾 病 hCG5‘转录起始区低甲基化→非滋养层细 胞hCG ↑ →受体结合→ ⊕cAMP信号途径 → 调节其它生长因子产生，促进Tumor形成 ↑
2. 缺失（delelation）是一个或多个核苷 酸的丢失：在基因一级结构中某个位点 上，一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失 造成的基因结构改变。
3. 插入（insertion）
基因突变的类型
4. 倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因 内部的DNA序列重组，使一段DNA序 列的方向倒转。 5. 配子突变与体细胞突变 6. 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传 递而改变（dynamic mutation）
血红蛋白结构
• 血红蛋白是由4条肽链（两个α和两个β链）组成
的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合
一个血红素。
•血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧 的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互 作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红 蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同
性。
• 血红蛋白分子一级结构上的轻微差
别就可能导致功能上的很大不同， 正常成年人血红蛋白中的β 链的第
六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就
会导致镰刀形细胞贫血病的异常血 红蛋白HbS 的生成。
血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症
血红蛋白病类型
异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。
地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋 白合成障碍性贫血。
四、基因调控序列变异导致表达水平变化 引起疾病
• 通过对β珠蛋白基因的转录调控序列研究，发 现这些调控序列如发生基因突变，就会降低β
珠蛋白基因的转录水平， β珠蛋白合成减少，
引起β型地中海性贫血。 • 除了调控序列改变会影响相应基因的表达外， 基因内的内含子变异也会影响蛋白质合成。
20
二、细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病
确定其在疾病中作用。
• 方法：Northern杂交法，消减杂交技术、差异显示法、定 量RT-PCR、基因表达芯片等．
35
差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR)
在不同的生长时期、在个体的发育与分化的 不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的 环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因 的差别表达（differential expression）。
移码突变(frame-shift mutation)
• 指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱 基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码 时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢 失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移 码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终 止密码子推后或提前出现。
(2) 基因突变影响 hnRNA 的剪接
•
• 四、病原生物基因的体内表达 1、外原病原生物进入人体内，大量繁殖，生长，引起机 械或生物学损伤
2、与人体争夺营养，引起疾病
3、产生生物毒素作用人体，引起疾病 4、外源基因的整合到人基因组上，引变了一些基因结构 或表达。
23
二、基因结构和表达与疾病的研究策略
1．通过结构分析确定基因变异
核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、
基本原理： 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片 段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双 链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割， 错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳 可确定是否存在突变。
化学切割错配法 特点： • 突变检出率高； • 如使用荧光检测系统，灵敏度较高； • 可检测长度达 2Kb的核酸片段； • 步骤多、费时、有毒； • 如对正义链与反义链都进行分析,检测率 达100%.
检测缺失突变只适于200-300bp长度片段,
且不能确定位置,检出率只有80%.
化学切割错配法 （Chemical cleavage of mismatch, CCM）
抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH)
• 原理
SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基
因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA 退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA， 使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内 退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反 向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作 为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段 的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。
• 同义突变(same sense mutation)： 密码子发生改变, 但所编码的氨基
酸不变。 例如：CUU CUC CUG → 亮氨酸
• 错义突变（missense mutation） 指DNA分子中碱基的取代，经转录产生的 mRNA后，相应密码子发生改变，编码另一种氨 基酸，使蛋白质中的氨基酸组成和排列顺序发生 改变。
构与表达的改变是疾病发生发展的重要机制。
第一节 不同基因通过不同机制导致疾病发生
蛋白质功能紊乱是疾病发生的基因病理机制，但
不同的基因通过不同机制引起蛋白质功能紊乱。 基因结构改变
环境因素影响了基因的表达
外源致病基因的进入表达：产生了毒性蛋白；产 生了合成非蛋白毒性物
质的酶。
3
一、基因结构改变导致蛋白质结构或
核糖核酸酶切分析（RNase cleavage） 缺点：
• 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸
酶切割效率低甚至不切割；
• 分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时
分析DNA的两条链，突变检出率为 70%；
• 需要制备特异性的RNA探针
杂合双链分析法 （heteroduplex analgsis, HA）
原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行 扩增。
3’端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结 构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的 排列组合：
根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就 将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两 个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN 表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的 任一种。这种引物称锚定引物。
4. 倒位是一段核苷酸序列方向倒转
基因突变还分为配子突变与体细胞突变
动态突变指串联重复序列（拷贝数）随世代的传
递而改变。
基因突变的类型
1. 点突变:单个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上，一种碱基 被另一种碱基取代。
分为：
转换 （transition） 颠换 （来自百度文库ransversion）
基因突变的类型
酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage )
• 酶促切割错配是一种与Rnase酶切分析相类似的 方法. • 不同之处是该方法采用的酶是T4核酸内切酶Ⅶ 能够识别12种错配的碱基,并在错配碱基附近进 行酶切. 优点: 对检测DNA片段可用DNA探针杂交检测. 最长检测长度达到1.5Kb. 缺点: 可出现非特异性切割,对错配认别也不是100%.
5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机 引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些 分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点 上。
用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可 获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找 更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以 及尽可能多的5’随机引物。
化学切割错配、酶促切割错配 2．基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析 3．通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、 反义技术、基因诱导超表达
核糖核酸酶切分析
基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA： RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核 糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶 电泳分析酶切片段的大小，即可确定错 配的位置。
方法
• 提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经
识别 4 碱基的限制性内切酶切割 • 实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头 • 进行2轮差减杂交和抑制性PCR • 获得富集的目的基因
第五章
基因结构和表达变化 与疾病的关系
基因结构与表达异常与疾病
• 蛋白质是生命的物质基础，人体各种生命现象 和生命过程主要是通过蛋白质的生理功能体现。
• 疾病的本质是由各种原因引起蛋白质的质和量
的改变的导致的蛋白质空间结构的紊乱。
• 蛋白质的质和量的改变从分子生物学角度讲，
又是基因结构及表达的改变的结果，故基因结
基因突变发生在 hnRNA 的一级结 构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最 终产生异常的蛋白表达产物，改变生 物性状。
(三) 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病
1. 血红蛋白病 (hemoglobinopathy)：
• 血红蛋白(hemoglobin, Hb)的结构特点 • 珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达
人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌 信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基 因表达也受到细胞间信号的调控。通过细胞间信 号传递，能保证基因表达的时间特异性和空间特 异性以及表达水平正常。 • AFP 是胚胎发育过程中表达的蛋白，具有免疫抑 制作用，保护胎儿免受母体免疫攻击。在接受异 常的细胞增殖信号作用下，其基因表达，导致肝 癌细胞逃避机体免疫监视。成为肝癌发生的重要 因素。
• 抑制性差减杂交 (SSH) --- Diatchenko L,
et al. PNAS 1996; 93:6025-6030 • Suppression subtractive hybridization:
a method for generating differentially
regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries
(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应
(1)基因突变引起遗传密码的改变：根据基因 突变产生的遗传效应不同分为
a. 同义突变 (consense mutation)
b. 错义突变 (missense mutation)
c. 无义突变 (nonsense mutation)
d. 移码突变（frame-shifting mutation）
无义突变：
由于碱基的取代、缺失或插入，使原来编 码某种氨基酸的密码子变成一个终止密码子的 基因突变叫无义突变 (nonsense mutation) 。
•酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为密码子UAG后 翻译便到此停止。 •亮氨酸的密码子UUA，中间的U变为A这样一个碱基变化 就会成为（终止密码子）UAA。
RFLP--Restriction Fragment Length Polyhmorphism
RFLPs
Microsatellite repeats
二、通过基因表达水平分析确定 基因在疾病发生中作用
• 人类疾病发生的另一个重要原因是基因表达水平的改变， 因基因表达水平的改变涉及的往往不是单一基因，而是多 基因，即一些基因表达增加，一些基因表达降低，导致由 其编码蛋白组成的代谢及调节系统异常，引发疾病。 • 因此通过基因水平找到正常与疾病状态下的差异表达基因，
量变化引起疾病
由于体内外各种因素改变了某基因特定的
DNA序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一 级结构发生改变，改变了基因结构即基因突 变。其分子机制可以是替换、插入或缺失， 因而产生不同的突变类型。
(一) 基因突变的多种类型
1. 点突变是单个碱基的改变：转换和颠换 2. 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 3. 插入是一个或多个核苷酸的增加
三、细胞内因素导致基因表达异常引起疾病
• 异常的细胞内信号导致基因表达异常引起 疾病
高血糖 → DAG↑ → ⊕PKC → ⊕ ACE → AngⅡ ↑
刺激蛋白质合成 心肌肥大
异常的DNA甲基化导致基因表达异常引起疾 病 hCG5‘转录起始区低甲基化→非滋养层细 胞hCG ↑ →受体结合→ ⊕cAMP信号途径 → 调节其它生长因子产生，促进Tumor形成 ↑
2. 缺失（delelation）是一个或多个核苷 酸的丢失：在基因一级结构中某个位点 上，一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失 造成的基因结构改变。
3. 插入（insertion）
基因突变的类型
4. 倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因 内部的DNA序列重组，使一段DNA序 列的方向倒转。 5. 配子突变与体细胞突变 6. 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传 递而改变（dynamic mutation）
血红蛋白结构
• 血红蛋白是由4条肽链（两个α和两个β链）组成
的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合
一个血红素。
•血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧 的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互 作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红 蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同
性。
• 血红蛋白分子一级结构上的轻微差
别就可能导致功能上的很大不同， 正常成年人血红蛋白中的β 链的第
六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就
会导致镰刀形细胞贫血病的异常血 红蛋白HbS 的生成。
血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症
血红蛋白病类型
异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。
地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋 白合成障碍性贫血。
四、基因调控序列变异导致表达水平变化 引起疾病
• 通过对β珠蛋白基因的转录调控序列研究，发 现这些调控序列如发生基因突变，就会降低β
珠蛋白基因的转录水平， β珠蛋白合成减少，
引起β型地中海性贫血。 • 除了调控序列改变会影响相应基因的表达外， 基因内的内含子变异也会影响蛋白质合成。
20
二、细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病
确定其在疾病中作用。
• 方法：Northern杂交法，消减杂交技术、差异显示法、定 量RT-PCR、基因表达芯片等．
35
差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR)
在不同的生长时期、在个体的发育与分化的 不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的 环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因 的差别表达（differential expression）。
移码突变(frame-shift mutation)
• 指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱 基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码 时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢 失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移 码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终 止密码子推后或提前出现。
(2) 基因突变影响 hnRNA 的剪接
•
• 四、病原生物基因的体内表达 1、外原病原生物进入人体内，大量繁殖，生长，引起机 械或生物学损伤
2、与人体争夺营养，引起疾病
3、产生生物毒素作用人体，引起疾病 4、外源基因的整合到人基因组上，引变了一些基因结构 或表达。
23
二、基因结构和表达与疾病的研究策略
1．通过结构分析确定基因变异
核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、
基本原理： 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片 段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双 链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割， 错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳 可确定是否存在突变。
化学切割错配法 特点： • 突变检出率高； • 如使用荧光检测系统，灵敏度较高； • 可检测长度达 2Kb的核酸片段； • 步骤多、费时、有毒； • 如对正义链与反义链都进行分析,检测率 达100%.