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基因结构与表达分析的基本策略
Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes
分子生物学系
1
分子生物学的三大核心技术
DNA序列分析—DNA测序，1977 聚合酶链式反应—DNA扩增，1985 DNA重组技术—基因克隆，1973
2
主要内容
一、DNA序列分析 二、核酸分子杂交 三、聚合酶链式反应 四、基因芯片和微阵列 五、 Western免疫印迹
3
一、DNA序列分析
（一）双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977)
（二）DNA自动化序列分析 （三）化学降解法(Gilbert ,1977)
4
The Nobel Prize in Chemistry 1980
（二）Northern印迹杂交：检测RNA (Northern blot hybridization) Stark GR，1977
30
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待检测的 靶单链DNA或RNA局部互补结合形成 杂交双链。
应用：核酸靶DNA或RNA序列的 定性与定量分析。
31
32
印迹技术
34 34
（一）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交原理
将电泳分离的待测DNA片段结合到 一定的固相支持物上，然后与存在于液 相中标记的核酸探针进行杂交的过程。
应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定
量分析。
35
Southern印迹杂交基本过程
1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4. 凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链） 5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交 7. 杂交结果显示
17
（二）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4
种ddNTP终止反应产物，替代放射 性同位素标记是实现DNA测序自动 化的基础。
18
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddGTP dGTP
ddCTP dCTP
ddATP dATP
ddTTP dTTP
19
20
表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分
利用各种物理方法使电泳胶中的生物 大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。
这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的 墨迹，因此称之为“blotting”, 译为印迹 技术。
33
探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标 记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”。
探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结 合，判断是否有同源的核酸分子存在。
22
Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 23
（三）化学降解法
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
24
化学降解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行同位素 标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别 用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性 切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基 处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自 显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。
别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一
个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型
21
4种不同荧光染料标记终止物ddNTPs Sanger测序反应
反应产物同一泳道电泳分离
激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，发射出四种不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序
DNA自动测序步骤
28
• Solexa 测序：在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序 （ SBS － sequencing by synthesis ）。
完成人类基因组草图不同测序仪的比较图
29
二、核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
（一）Southern印迹杂交：检测DNA (Southern blot hybridization) Southern EM , 1975
4
7
11
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddATP ddGTP dGTP dCTP
ddCTP dATP
ddTTP dTTP
A G CT
12
2. DNA测序主要步骤
13
G反应管 T反应管
A反应管
测序步骤
● 单链DNA模板的制备 ● DNA模板与测序引物退火 ● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应 ● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
Walter Gilbert 1932～
Paul Berg 1926～
Frederick Sanger 1918～
5
DNA测序技术基础： 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的 单链寡核苷酸DNA片段。
8
掺入N个核苷酸
DNA合成反应模式图
9
引物
DNA单链模板
延伸的新合成链
掺入ddNTP 末端终止
10
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸 的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二 酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于 ddNTP 。
11
25
化学降解G反应模式图
Met
硫酸二甲酯
Met
Met Met
哌啶
26
最新测序技术
• 454技术(Roche ) • 焦磷酸测序（Pyrosequencing） • Solexa测序技术(Illumina ) • SOLiD技术(ABI ) • 连接法测序
27
举例：Solexa测序
HiSeq 2000
6
(一）双脱氧末端终止法 （dideoxy chain termination）
7
ATP、dATP和ddATP的结构
A
dddAAATTTPPP
OHH HOH
NTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；
dNTP: 脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；
ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；
Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes
分子生物学系
1
分子生物学的三大核心技术
DNA序列分析—DNA测序，1977 聚合酶链式反应—DNA扩增，1985 DNA重组技术—基因克隆，1973
2
主要内容
一、DNA序列分析 二、核酸分子杂交 三、聚合酶链式反应 四、基因芯片和微阵列 五、 Western免疫印迹
3
一、DNA序列分析
（一）双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977)
（二）DNA自动化序列分析 （三）化学降解法(Gilbert ,1977)
4
The Nobel Prize in Chemistry 1980
（二）Northern印迹杂交：检测RNA (Northern blot hybridization) Stark GR，1977
30
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待检测的 靶单链DNA或RNA局部互补结合形成 杂交双链。
应用：核酸靶DNA或RNA序列的 定性与定量分析。
31
32
印迹技术
34 34
（一）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交原理
将电泳分离的待测DNA片段结合到 一定的固相支持物上，然后与存在于液 相中标记的核酸探针进行杂交的过程。
应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定
量分析。
35
Southern印迹杂交基本过程
1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4. 凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链） 5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交 7. 杂交结果显示
17
（二）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4
种ddNTP终止反应产物，替代放射 性同位素标记是实现DNA测序自动 化的基础。
18
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddGTP dGTP
ddCTP dCTP
ddATP dATP
ddTTP dTTP
19
20
表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分
利用各种物理方法使电泳胶中的生物 大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。
这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的 墨迹，因此称之为“blotting”, 译为印迹 技术。
33
探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标 记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”。
探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结 合，判断是否有同源的核酸分子存在。
22
Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 23
（三）化学降解法
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
24
化学降解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行同位素 标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别 用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性 切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基 处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自 显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。
别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一
个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型
21
4种不同荧光染料标记终止物ddNTPs Sanger测序反应
反应产物同一泳道电泳分离
激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，发射出四种不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序
DNA自动测序步骤
28
• Solexa 测序：在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序 （ SBS － sequencing by synthesis ）。
完成人类基因组草图不同测序仪的比较图
29
二、核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
（一）Southern印迹杂交：检测DNA (Southern blot hybridization) Southern EM , 1975
4
7
11
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddATP ddGTP dGTP dCTP
ddCTP dATP
ddTTP dTTP
A G CT
12
2. DNA测序主要步骤
13
G反应管 T反应管
A反应管
测序步骤
● 单链DNA模板的制备 ● DNA模板与测序引物退火 ● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应 ● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
Walter Gilbert 1932～
Paul Berg 1926～
Frederick Sanger 1918～
5
DNA测序技术基础： 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的 单链寡核苷酸DNA片段。
8
掺入N个核苷酸
DNA合成反应模式图
9
引物
DNA单链模板
延伸的新合成链
掺入ddNTP 末端终止
10
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸 的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二 酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于 ddNTP 。
11
25
化学降解G反应模式图
Met
硫酸二甲酯
Met
Met Met
哌啶
26
最新测序技术
• 454技术(Roche ) • 焦磷酸测序（Pyrosequencing） • Solexa测序技术(Illumina ) • SOLiD技术(ABI ) • 连接法测序
27
举例：Solexa测序
HiSeq 2000
6
(一）双脱氧末端终止法 （dideoxy chain termination）
7
ATP、dATP和ddATP的结构
A
dddAAATTTPPP
OHH HOH
NTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；
dNTP: 脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；
ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；