基因结构与表达分析的基本策略PPT
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生物化学及分子生物学(人卫第九版)25基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆PPT课件
在基因数据库中，初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基速扩增（RACE）技术是高效钓取未知基因编码序列的一种方法。
3. 用RNA剪接分析法确定基因编码序列
选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（expression sequence tag, EST）的 比较进行鉴定。
基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导 入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的 表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因 功能。
方法： 转基因技术 基因敲入技术
1. 用转基因技术获得基因功能
转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精 卵或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即ES细胞，通过随机重组 使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受 体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。
第二十五章
基因结构功能分析 和疾病相关基因克隆鉴定
作者 :
:
目录
第一节 基因结构分析 第二节 基因功能研究 第三节 疾病相关基因鉴定克隆原则 第四节 鉴定克隆疾病相关基因的策略和方法
重点难点
掌握 鉴度的技术及原理；分析表达产物的主要技术；基 因功能研究的方法技术。
转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出 的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基 因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和 鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。
三、分析基因表达的产物可采用组学方法和特 异性测定方法
基因表达产物包括RNA和蛋白质/多肽，因 此分析基因表达可以从RNA和蛋白质/多肽水平 上进行。
3. 用RNA剪接分析法确定基因编码序列
选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（expression sequence tag, EST）的 比较进行鉴定。
基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导 入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的 表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因 功能。
方法： 转基因技术 基因敲入技术
1. 用转基因技术获得基因功能
转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精 卵或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即ES细胞，通过随机重组 使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受 体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。
第二十五章
基因结构功能分析 和疾病相关基因克隆鉴定
作者 :
:
目录
第一节 基因结构分析 第二节 基因功能研究 第三节 疾病相关基因鉴定克隆原则 第四节 鉴定克隆疾病相关基因的策略和方法
重点难点
掌握 鉴度的技术及原理；分析表达产物的主要技术；基 因功能研究的方法技术。
转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出 的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基 因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和 鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。
三、分析基因表达的产物可采用组学方法和特 异性测定方法
基因表达产物包括RNA和蛋白质/多肽，因 此分析基因表达可以从RNA和蛋白质/多肽水平 上进行。
基因的表达和结构
甲硫氨酸
起始密码子
AUG
GUG
缬氨酸
终止密码子
UAA
UAG
UGA
不决定氨基酸
密码子在不同信使RNA上的通用性：
任何生物的任何细胞的信使RNA上的密码 子都是64种，
所有生物共用一套密码子，成为基因工程得以实现的理论依据之一。
01
02
03
携带特异氨基酸
tRNA与反密码子
反密码子
反密码子
A
C
01
02
基因对性状的控制
B
A．198个 B．398个 C．400个 D．798个
某基因中含有1200个碱基对，则由它控制合成的含有两条肽链的蛋白质分子中含有肽键的个数是 ( )
Gene中碱基数：mRNA中碱基数：蛋白质中的氨基酸数=6：3：1；因此，合成的蛋白质中的氨基酸数为1200*2/6=400个；又此蛋白质有两条肽链，所以其中含有的肽键数为400-2=398个。
解旋酶 DNA聚合酶等
细胞代谢产生的能量
形成姐妹单体上两个一模一样的DNA分子
7复制特点
①边解旋边复制 ②半保留复制
2、复制的过程
：解旋酶催化
解旋
模板
（在DNA聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行）
复制
：以母链为模板进行碱基配对
：组成
复制后的DNA
同时进行
DNA复制的准确性如何保障？
碱基互补配对原则使复制准确无误
翻译的过程（细胞质中）
U
C
A
U
G
A
U
U
A
A
A
U
亮氨酸
A
C
U
天冬氨酸
核糖体
起始密码子
AUG
GUG
缬氨酸
终止密码子
UAA
UAG
UGA
不决定氨基酸
密码子在不同信使RNA上的通用性：
任何生物的任何细胞的信使RNA上的密码 子都是64种，
所有生物共用一套密码子，成为基因工程得以实现的理论依据之一。
01
02
03
携带特异氨基酸
tRNA与反密码子
反密码子
反密码子
A
C
01
02
基因对性状的控制
B
A．198个 B．398个 C．400个 D．798个
某基因中含有1200个碱基对，则由它控制合成的含有两条肽链的蛋白质分子中含有肽键的个数是 ( )
Gene中碱基数：mRNA中碱基数：蛋白质中的氨基酸数=6：3：1；因此，合成的蛋白质中的氨基酸数为1200*2/6=400个；又此蛋白质有两条肽链，所以其中含有的肽键数为400-2=398个。
解旋酶 DNA聚合酶等
细胞代谢产生的能量
形成姐妹单体上两个一模一样的DNA分子
7复制特点
①边解旋边复制 ②半保留复制
2、复制的过程
：解旋酶催化
解旋
模板
（在DNA聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行）
复制
：以母链为模板进行碱基配对
：组成
复制后的DNA
同时进行
DNA复制的准确性如何保障？
碱基互补配对原则使复制准确无误
翻译的过程（细胞质中）
U
C
A
U
G
A
U
U
A
A
A
U
亮氨酸
A
C
U
天冬氨酸
核糖体
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
医学课件基因结构与基因表达调控
善疾病治疗的效果。
胚胎成长。
的发生。
研究方法与技术
转录组学
这种技术可以研究一个样本中 的所有基因的表达水平变化， 以了解这些基因在特定细胞或 组织中扮演的角色。
蛋白质组学
这种技术可以同时研究一个样 品中的所有蛋白质，以探究它 们的结构和功能。
基因工程技术
这种技术可以用来修改某些基 因的表达，进而改变它们的功 能。
DNA结构
DNA是一条双螺旋的分子， 由碱基、糖和磷酸组成。这 种结构保证了基因信息的传 递。
基因表达调控
1
转录的过程
转录是指将DNA中的信息转化为RNA的过程。这需要核酸酶、启动子和转录因子 等蛋白质的参与。
2
转录调控因子
调控因子可以促进或抑制转录的发生，这些因子包括组蛋白修饰、DNA甲基化、 基因启动子和转录因子。
3
转录后调控
RNA成熟后需要经历剪切、拼接和调控，才能最终合成蛋白质。
基因调控的机制
Байду номын сангаас
DNA甲基化
通过增加DNA上的甲基基团，可 以抑制或促进基因的表达。
组蛋白修饰
染色质的结构与调控
组蛋白是DNA包裹的蛋白质。通 过改变组蛋白的化学修饰，可以 影响附着在其上的DNA的可读性。
基因调控还可以受到染色质的定 位和异构的影响。
医学课件基因结构与基因 表达调控
基因是生命的基本遗传单位，它们掌控着我们的身体构造和功能。在这个课 件中，我们将学习基因的结构和表达调控，以及这些概念对发育和疾病的影 响。
基因结构
组成
基因通常由DNA序列组成， 这些序列包括编码和非编码 区域。
分类
基因可以按照不同的标准进 行分类，例如它们的功能、 位置、和起始子有无等。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
第三章--基因与基因组的结构PPT课件
-
4
③近20年来，由于重组DNA技术的完善和应 用，人们已经改变了从表型到基因型的传统 研究基因的途径，而能够直接从克隆目的基 因出发，研究基因的功能及其与表型之间的 关系，使基因的研究进入了反向生物学阶段。
-
5
• 反向生物学：指利用重组DNA技术和离体 定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的 功能，在体外使基因突变，再导入体内，检 测突变的遗传效应即表型的过程。
• 例如，对于大肠杆菌和其他细菌，用三个小写
字母表示一个操纵子，接着的大写字母表示不
同基因座，lac 操纵子的基因座：lacZ，lacY， lacA；其表达产物蛋白质则是lacZ，lacY，
lacA。
-
37
• 3．质粒和其他染色体外成分的命名 • 自然产生的质粒，用三个正体字母表示，第—
个字母大写，例如：ColEⅠ；
血破裂而使血红蛋白计数减少，造成贫血。
• 其本质是其血红蛋白的β-链与正常野生型
β-链之间的第6位氨基酸，由Val取代了 Glu所致。
-
32
• 这种贫血病是由基因突变造成的一种分子病，
除溶血后发生贫血外，还会堵塞血管形成栓塞， 从而伤及多种器官。
• 它的纯合子(通过单倍体形成的纯系双倍体)患
者在童年就夭折。
-
40
• 6．线虫基因的命名
• 用三个小写斜体字母表示突变表型，如存
在不止一个基因座，则在连字符后用数字
表示，如基因unc-86，ced-9；蛋白UNC-
86；CED-9。
-
41
• 7．植物基因的命名
• 多数用1～3个小写英文斜体字母表示。
-
42
• 8．脊椎动物基因的命名
《基因克隆与表达》课件
总结基因克隆与表达的重要性，并鼓励进一步学习和研究。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
基因的结构和功能PPT课件
基因与生物性状物体 的性状。
02 基因的表达水平可以影响生物体的表现型，如身 高、肤色、眼睛颜色等。
03 基因与环境因素的相互作用也可以影响生物体的 表现型，如饮食习惯、运动习惯等。
05
基因工程和基因编辑
基因工程的定义和应用
基因工程的定义
基因工程是一种通过人工操作和 改变生物体的遗传物质来改变其 性状的技术。
基因工程的应用
基因工程在农业、医学、工业和 基础生物学研究中有着广泛的应 用，例如转基因作物、基因治疗 、基因检测和基因克隆等。
基因编辑技术及其应用
基因编辑技术的定义
基因编辑技术是一种能够精确地修改生物体基因组的工具，包括CRISPR-Cas9、 ZFNs和TALENs等。
基因编辑技术的应用
基因编辑技术被广泛应用于基础生物学研究、疾病治疗、作物改良和动物育种 等领域，例如用于治疗遗传性疾病、抗病抗虫作物的培育以及动物模型的构建 等。
DNA的分子结构
双螺旋结构
DNA由两条反向平行的链 组成，通过碱基配对形成 双螺旋结构。
碱基配对
A与T配对，G与C配对， 形成稳定的碱基对。
方向性
DNA的两条链方向相反， 一条链是5'到3'方向，另 一条链是3'到5'方向。
基因的组成和结构
基因定义
基因是遗传信息的基本单位，负责编码蛋白质或多肽。
基因结构
基因由编码区和非编码区组成。编码区包含有意义的核苷酸序列，负 责转录和翻译为蛋白质或多肽。非编码区则调控基因的表达。
基因复制
DNA复制是半保留复制，即亲代DNA的每一条链作为模板合成子代 DNA的一条链。
基因突变
基因突变是指基因序列的改变，可能导致遗传信息的改变，从而影响 生物体的表型。
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基因结构与表达分析的基本策略
Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes
分子生物学系
1
分子生物学的三大核心技术
DNA序列分析—DNA测序，1977 聚合酶链式反应—DNA扩增，1985 DNA重组技术—基因克隆，1973
2
主要内容
一、DNA序列分析 二、核酸分子杂交 三、聚合酶链式反应 四、基因芯片和微阵列 五、 Western免疫印迹
3
一、DNA序列分析
（一）双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977)
（二）DNA自动化序列分析 （三）化学降解法(Gilbert ,1977)
4
The Nobel Prize in Chemistry 1980
（二）Northern印迹杂交：检测RNA (Northern blot hybridization) Stark GR，1977
30
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待检测的 靶单链DNA或RNA局部互补结合形成 杂交双链。
应用：核酸靶DNA或RNA序列的 定性与定量分析。
31
32
印迹技术
34 34
（一）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交原理
将电泳分离的待测DNA片段结合到 一定的固相支持物上，然后与存在于液 相中标记的核酸探针进行杂交的过程。
应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定
量分析。
35
Southern印迹杂交基本过程
1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4. 凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链） 5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交 7. 杂交结果显示
17
（二）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4
种ddNTP终止反应产物，替代放射 性同位素标记是实现DNA测序自动 化的基础。
18
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddGTP dGTP
ddCTP dCTP
ddATP dATP
ddTTP dTTP
19
20
表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分
利用各种物理方法使电泳胶中的生物 大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。
这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的 墨迹，因此称之为“blotting”, 译为印迹 技术。
33
探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标 记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”。
探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结 合，判断是否有同源的核酸分子存在。
22
Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 23
（三）化学降解法
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
24
化学降解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行同位素 标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别 用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性 切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基 处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自 显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。
别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一
个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型
21
4种不同荧光染料标记终止物ddNTPs Sanger测序反应
反应产物同一泳道电泳分离
激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，发射出四种不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序
DNA自动测序步骤
28
• Solexa 测序：在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序 （ SBS － sequencing by synthesis ）。
完成人类基因组草图不同测序仪的比较图
29
二、核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
（一）Southern印迹杂交：检测DNA (Southern blot hybridization) Southern EM , 1975
4
7
11
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddATP ddGTP dGTP dCTP
ddCTP dATP
ddTTP dTTP
A G CT
12
2. DNA测序主要步骤
13
G反应管 T反应管
A反应管
测序步骤
● 单链DNA模板的制备 ● DNA模板与测序引物退火 ● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应 ● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
Walter Gilbert 1932～
Paul Berg 1926～
Frederick Sanger 1918～
5
DNA测序技术基础： 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的 单链寡核苷酸DNA片段。
8
掺入N个核苷酸
DNA合成反应模式图
9
引物
DNA单链模板
延伸的新合成链
掺入ddNTP 末端终止
10
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸 的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二 酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于 ddNTP 。
11
25
化学降解G反应模式图
Met
硫酸二甲酯
Met
Met Met
哌啶
26
最新测序技术
• 454技术(Roche ) • 焦磷酸测序（Pyrosequencing） • Solexa测序技术(Illumina ) • SOLiD技术(ABI ) • 连接法测序
27
举例：Solexa测序
HiSeq 2000
6
(一）双脱氧末端终止法 （dideoxy chain termination）
7
ATP、dATP和ddATP的结构
A
dddAAATTTPPP
OHH HOH
NTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；
dNTP: 脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；
ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；
Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes
分子生物学系
1
分子生物学的三大核心技术
DNA序列分析—DNA测序，1977 聚合酶链式反应—DNA扩增，1985 DNA重组技术—基因克隆，1973
2
主要内容
一、DNA序列分析 二、核酸分子杂交 三、聚合酶链式反应 四、基因芯片和微阵列 五、 Western免疫印迹
3
一、DNA序列分析
（一）双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977)
（二）DNA自动化序列分析 （三）化学降解法(Gilbert ,1977)
4
The Nobel Prize in Chemistry 1980
（二）Northern印迹杂交：检测RNA (Northern blot hybridization) Stark GR，1977
30
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待检测的 靶单链DNA或RNA局部互补结合形成 杂交双链。
应用：核酸靶DNA或RNA序列的 定性与定量分析。
31
32
印迹技术
34 34
（一）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交原理
将电泳分离的待测DNA片段结合到 一定的固相支持物上，然后与存在于液 相中标记的核酸探针进行杂交的过程。
应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定
量分析。
35
Southern印迹杂交基本过程
1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4. 凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链） 5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交 7. 杂交结果显示
17
（二）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4
种ddNTP终止反应产物，替代放射 性同位素标记是实现DNA测序自动 化的基础。
18
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddGTP dGTP
ddCTP dCTP
ddATP dATP
ddTTP dTTP
19
20
表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分
利用各种物理方法使电泳胶中的生物 大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。
这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的 墨迹，因此称之为“blotting”, 译为印迹 技术。
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探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标 记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”。
探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结 合，判断是否有同源的核酸分子存在。
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Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 23
（三）化学降解法
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
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化学降解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行同位素 标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别 用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性 切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基 处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自 显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。
别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一
个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型
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4种不同荧光染料标记终止物ddNTPs Sanger测序反应
反应产物同一泳道电泳分离
激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，发射出四种不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序
DNA自动测序步骤
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• Solexa 测序：在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序 （ SBS － sequencing by synthesis ）。
完成人类基因组草图不同测序仪的比较图
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二、核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
（一）Southern印迹杂交：检测DNA (Southern blot hybridization) Southern EM , 1975
4
7
11
5′ T A C G C T G A A T G A 3′
ddATP ddGTP dGTP dCTP
ddCTP dATP
ddTTP dTTP
A G CT
12
2. DNA测序主要步骤
13
G反应管 T反应管
A反应管
测序步骤
● 单链DNA模板的制备 ● DNA模板与测序引物退火 ● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应 ● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
Walter Gilbert 1932～
Paul Berg 1926～
Frederick Sanger 1918～
5
DNA测序技术基础： 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的 单链寡核苷酸DNA片段。
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掺入N个核苷酸
DNA合成反应模式图
9
引物
DNA单链模板
延伸的新合成链
掺入ddNTP 末端终止
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1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸 的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二 酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于 ddNTP 。
11
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化学降解G反应模式图
Met
硫酸二甲酯
Met
Met Met
哌啶
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最新测序技术
• 454技术(Roche ) • 焦磷酸测序（Pyrosequencing） • Solexa测序技术(Illumina ) • SOLiD技术(ABI ) • 连接法测序
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举例：Solexa测序
HiSeq 2000
6
(一）双脱氧末端终止法 （dideoxy chain termination）
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ATP、dATP和ddATP的结构
A
dddAAATTTPPP
OHH HOH
NTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；
dNTP: 脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；
ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；