生物制药第六章ppt课件
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第六章 核酸类药物
本章主要内容 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 主要核酸类药物的生产工艺
本章要求 （1）掌握酶解法制备核苷酸的方法 （2）掌握发酵法生产肌苷酸的基本方法； （3）了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等的生产方法； （4）了解核酸类药物的分类以及主要临床用途
第一节 核酸类物质的分离提取及其发 酵生产
酶-化学合成法制备阿糖尿苷工艺路线
氧氯化磷
氧 桥 化
二甲基甲酰胺 合物（水解）
化学催化
（原料1）
原料2
酶催化
酶催化
（三）作用与用途 作用：广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型， 带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明 显抑制作用 用途：治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。
三、三氮唑核苷（熟悉） （一）结构与性质
碱解液
中和，离心
6mol/L HCL，
pH7,15min
沉淀
清液
10 ℃， Ph2.5
6mol/L HCL
离心 置冷过夜
1.8g RNA （纯度80％）
粗品DNA
蒸馏水，5％SDS 离心
清液
搅拌1h
5000r/pm
沉淀
DNA沉淀
NaCL，95％冷乙醇
洗涤、真空干燥
活性DNA
乙醇、丙酮
二、核苷酸的制备方法（熟悉） 水解法（DNA或RNA经酶或碱水解） 发酵法 半合成法
第二节 核酸类药物
核酸类药物的分类： 第一类：天然核酸类物质 （与代谢障碍疾病有关） 第二类：自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或 聚合物 （抗病毒、肿瘤、艾滋病药物，产生干扰素、免疫抑制）
一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT） （一）结构与性质
AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病药
（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸
.
1
酶
解
法
制
备
脱
桔青霉产生核酸酶P1
氧
核
苷
酸
核酸酶P1 －－－酶法生产5‘核苷酸的主要工业用酶 来源：桔青霉(Penicillium citrinum)发酵
催化特性： 1）水解单链RNA和DNA中的3’----5’磷酸二酯键 （磷酸二酯酶活力强） 2）水解单核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸单酯键
某一特定的范围内累积大量核苷。
1．发酵法生产肌苷 菌种：枯草杆菌
保藏斜面菌种 32 ℃活化,20h
32 ℃,15h
生产斜面种
一级种子液 1 %接种量32 ℃,8h 二级种子液 1 0%接种量
1.2L 发酵罐
过滤，除菌体
阳离子交换树脂
发酵液
发酵清液
洗脱液
活性炭吸附
减压浓缩、冷冻结晶
洗脱液
肌苷粗品
其它产肌苷菌种：产氨短杆菌
半合成法制备核苷酸的基本路线：
发酵法生产核苷提取、精制 磷酸化 5′-核苷酸 发酵
磷酸化反应，2h
肌苷 ＋ 氯化氧磷 磷酸三乙酯，水
5′-IMP(产率91％）
三、核苷的制备 化学法 发酵法
（－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程（图14·8）
1.水解
（鸟苷＋腺苷＋尿苷＋胞苷）＋磷酸
5′-甲基尿苷
化 学 法
胸苷
二、阿糖腺苷Adenine arabinoside （一）结构与性质
化学名：9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉 伯糖苷。 已有合成方法： 发酵法 酶转化法
阿糖脲苷
尿嘧啶磷酸化酶
阿糖腺苷
嘌呤核苷磷酸化酶
（二）生产工艺 1、酶-化学合成法
原料：尿苷 过程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应、水解反应、酶 法转化。
对菌种的要求：
1）使用腺嘌呤缺陷型菌株（解除腺嘌呤衍生物的反馈 抑制）
2）菌体自身的5’－核苷酸降解酶活力低
3 ） 选 用 Mn2+ 不 敏 感 性 变 异 株 （ 培 养 基 中 添 加 限 量 Mn2+，以增加细胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量合 成）
（三）半合成法制备核苷酸
工业生产的呈味核苷酸约有40-50％是由半合成法而制得
‘
2 、 酶 解 法 制 备 5 － 单 核 苷 酸
CCMMPP
CMCPMP
3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G） I+G：呈味核苷酸
4．菌体自溶法生产核苷酸
原理：磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生 5′-核苷酸。
（1）谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸工艺流程：
5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
（二）生产工艺 以胸苷为起始原料进行化学合成
叠氮胸苷的合成工艺路线
工艺特点：原料来源少，合成路线复杂，成本高。
起始原料胸苷的制备方法： ① DNA水解法 （主要方法）
2′-脱氧鸟苷
② 2′-脱氧胞苷
2＇-脱氧腺苷
大肠杆菌磷酸化酶
+ 胸腺嘧啶
胸苷
鸟苷 ＋ 胸腺嘧啶
嘌呤核苷磷酸化酶 嘧啶核苷磷酸化酶
一、核酸（DNA与RNA)的提取与制备 （了解） 1、工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源
酵母菌主要生长在偏酸性的潮湿的含 物理诱变：射线糖、环离境子中束，、例微如波，、在超水声果波、蔬菜、蜜 化学 诱变：硫酸饯二的乙内酯部（和D表FS面）以亚及硝在基果胍园土壤中最
（2）高RNA（生含N物T量诱G酵变）：母等病菌原株微的生筛物诱选变，为转常基见因。诱变 1.从自然界筛选
RNA水溶液 3％～3.5% 中和
6mol／L盐酸
碱解
保温
0.3mol/lNaoH 38℃，16-20h
2′，3‘-核苷酸
水解液
2’,3’环状磷酸酯
RNA
分解
注意：酶法降解RNA得到的是5’－核苷酸 碱水解法降解RNA生产2’，3’混合核苷酸
（二）发酵法生产核苷酸
1．发酵法生产肌苷酸（IMP）
菌种：产氨短杆菌
（腺苷＋尿苷＋胞苷）
（阳离子交换）
2.离子交换分离
3.浓缩
阴离子交换
4.结晶
阴离子交换
图14.8 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷生产工艺流程图
（二）发酵法生产核苷 规模： 千吨/年 优点：产量大，周期短，易控制。 产核苷菌株的共同特点： ①选用磷酸单酯酶活力强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆
菌的诱变出发菌株； ② 用物理或化学法筛选出诱变菌 ③发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在
2.诱变育种
（3）用工业废水培养高含量RNA酵母
菌体在味精废水中（ 还原糖0.7％ 总糖 1.2％ 总氮
0.2％ 总磷0.5％ 无机盐 0.1％-0.2％ ）驯化培养，发
酵24小时，RNA含量8％-10％
Fra Baidu bibliotek
（4）RNA提取实例
100g压 榨啤酒 酵母
碱解
230ml1.3%NaOH 20 ℃,30min
本章主要内容 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 主要核酸类药物的生产工艺
本章要求 （1）掌握酶解法制备核苷酸的方法 （2）掌握发酵法生产肌苷酸的基本方法； （3）了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等的生产方法； （4）了解核酸类药物的分类以及主要临床用途
第一节 核酸类物质的分离提取及其发 酵生产
酶-化学合成法制备阿糖尿苷工艺路线
氧氯化磷
氧 桥 化
二甲基甲酰胺 合物（水解）
化学催化
（原料1）
原料2
酶催化
酶催化
（三）作用与用途 作用：广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型， 带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明 显抑制作用 用途：治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。
三、三氮唑核苷（熟悉） （一）结构与性质
碱解液
中和，离心
6mol/L HCL，
pH7,15min
沉淀
清液
10 ℃， Ph2.5
6mol/L HCL
离心 置冷过夜
1.8g RNA （纯度80％）
粗品DNA
蒸馏水，5％SDS 离心
清液
搅拌1h
5000r/pm
沉淀
DNA沉淀
NaCL，95％冷乙醇
洗涤、真空干燥
活性DNA
乙醇、丙酮
二、核苷酸的制备方法（熟悉） 水解法（DNA或RNA经酶或碱水解） 发酵法 半合成法
第二节 核酸类药物
核酸类药物的分类： 第一类：天然核酸类物质 （与代谢障碍疾病有关） 第二类：自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或 聚合物 （抗病毒、肿瘤、艾滋病药物，产生干扰素、免疫抑制）
一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT） （一）结构与性质
AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病药
（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸
.
1
酶
解
法
制
备
脱
桔青霉产生核酸酶P1
氧
核
苷
酸
核酸酶P1 －－－酶法生产5‘核苷酸的主要工业用酶 来源：桔青霉(Penicillium citrinum)发酵
催化特性： 1）水解单链RNA和DNA中的3’----5’磷酸二酯键 （磷酸二酯酶活力强） 2）水解单核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸单酯键
某一特定的范围内累积大量核苷。
1．发酵法生产肌苷 菌种：枯草杆菌
保藏斜面菌种 32 ℃活化,20h
32 ℃,15h
生产斜面种
一级种子液 1 %接种量32 ℃,8h 二级种子液 1 0%接种量
1.2L 发酵罐
过滤，除菌体
阳离子交换树脂
发酵液
发酵清液
洗脱液
活性炭吸附
减压浓缩、冷冻结晶
洗脱液
肌苷粗品
其它产肌苷菌种：产氨短杆菌
半合成法制备核苷酸的基本路线：
发酵法生产核苷提取、精制 磷酸化 5′-核苷酸 发酵
磷酸化反应，2h
肌苷 ＋ 氯化氧磷 磷酸三乙酯，水
5′-IMP(产率91％）
三、核苷的制备 化学法 发酵法
（－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程（图14·8）
1.水解
（鸟苷＋腺苷＋尿苷＋胞苷）＋磷酸
5′-甲基尿苷
化 学 法
胸苷
二、阿糖腺苷Adenine arabinoside （一）结构与性质
化学名：9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉 伯糖苷。 已有合成方法： 发酵法 酶转化法
阿糖脲苷
尿嘧啶磷酸化酶
阿糖腺苷
嘌呤核苷磷酸化酶
（二）生产工艺 1、酶-化学合成法
原料：尿苷 过程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应、水解反应、酶 法转化。
对菌种的要求：
1）使用腺嘌呤缺陷型菌株（解除腺嘌呤衍生物的反馈 抑制）
2）菌体自身的5’－核苷酸降解酶活力低
3 ） 选 用 Mn2+ 不 敏 感 性 变 异 株 （ 培 养 基 中 添 加 限 量 Mn2+，以增加细胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量合 成）
（三）半合成法制备核苷酸
工业生产的呈味核苷酸约有40-50％是由半合成法而制得
‘
2 、 酶 解 法 制 备 5 － 单 核 苷 酸
CCMMPP
CMCPMP
3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G） I+G：呈味核苷酸
4．菌体自溶法生产核苷酸
原理：磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生 5′-核苷酸。
（1）谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸工艺流程：
5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
（二）生产工艺 以胸苷为起始原料进行化学合成
叠氮胸苷的合成工艺路线
工艺特点：原料来源少，合成路线复杂，成本高。
起始原料胸苷的制备方法： ① DNA水解法 （主要方法）
2′-脱氧鸟苷
② 2′-脱氧胞苷
2＇-脱氧腺苷
大肠杆菌磷酸化酶
+ 胸腺嘧啶
胸苷
鸟苷 ＋ 胸腺嘧啶
嘌呤核苷磷酸化酶 嘧啶核苷磷酸化酶
一、核酸（DNA与RNA)的提取与制备 （了解） 1、工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源
酵母菌主要生长在偏酸性的潮湿的含 物理诱变：射线糖、环离境子中束，、例微如波，、在超水声果波、蔬菜、蜜 化学 诱变：硫酸饯二的乙内酯部（和D表FS面）以亚及硝在基果胍园土壤中最
（2）高RNA（生含N物T量诱G酵变）：母等病菌原株微的生筛物诱选变，为转常基见因。诱变 1.从自然界筛选
RNA水溶液 3％～3.5% 中和
6mol／L盐酸
碱解
保温
0.3mol/lNaoH 38℃，16-20h
2′，3‘-核苷酸
水解液
2’,3’环状磷酸酯
RNA
分解
注意：酶法降解RNA得到的是5’－核苷酸 碱水解法降解RNA生产2’，3’混合核苷酸
（二）发酵法生产核苷酸
1．发酵法生产肌苷酸（IMP）
菌种：产氨短杆菌
（腺苷＋尿苷＋胞苷）
（阳离子交换）
2.离子交换分离
3.浓缩
阴离子交换
4.结晶
阴离子交换
图14.8 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷生产工艺流程图
（二）发酵法生产核苷 规模： 千吨/年 优点：产量大，周期短，易控制。 产核苷菌株的共同特点： ①选用磷酸单酯酶活力强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆
菌的诱变出发菌株； ② 用物理或化学法筛选出诱变菌 ③发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在
2.诱变育种
（3）用工业废水培养高含量RNA酵母
菌体在味精废水中（ 还原糖0.7％ 总糖 1.2％ 总氮
0.2％ 总磷0.5％ 无机盐 0.1％-0.2％ ）驯化培养，发
酵24小时，RNA含量8％-10％
Fra Baidu bibliotek
（4）RNA提取实例
100g压 榨啤酒 酵母
碱解
230ml1.3%NaOH 20 ℃,30min