2014凋亡细胞的诱导及检测--LX
08实验八+细胞凋亡的诱导和细胞凋
（2）高浓度盐Ca2+的处理：
100nmol/L或500nmol/L的CaCl2或NaCl处理洋葱 内表皮8h左右； 48h后用改良苯酚品红染液染 色30min，清洗；镜检。
三、材料和试剂
材料：人类淋巴细胞株、洋葱内表皮 试剂：100μmol/L cyt c的水溶液、 100nmol/L或500nmol/L的CaCl2、改良苯 酚品红染液
四、实验方法与步骤
1.取样
（1）人类淋巴细胞株的培养
（2）直接撕取洋葱内表皮细胞
2.细胞调亡的诱导 （1） cyt c处理： 共做三组样品。试验组样品要先经cyt c处 理，浓度为12.5 μmol/L，时间控制在48h左右； 正对照样品不需要处理，为正常生长的细胞； 负对照样品是将正常细胞煮沸10min，使其坏死。
五、 实验结果
形态学变化 调亡率统计
四、实验报告
设计一个刺激诱导PCD的实验。
（3）不同机械刺激的处理（温和）：
冷激、热激、振荡等
3.形态学观察 在显微镜下观察细胞形态变化，比较和描述不同调
亡诱导，诱导细胞调亡形态变化的异同点并对试验
组细胞进行调亡率统计。
计算调亡率＝（调亡细胞数/总细胞数）×100％。
在光学显微镜下照相（数码互动显微镜）。
4.DNA电泳（梯状DNA）
实验八 细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的 形态特征的观察
一、实验目的
了解细胞调亡的原理；
掌握用于细胞调亡检测的常规方法。
二、实验原理
细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可 分为两种类型：细胞坏死和细胞程序性死亡 （PCD），也称细胞调亡。 细胞程序性死亡分为两类：受体介导的细胞程 序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。 调亡细胞的形态学观察：HE染色、Giemsa染色、 台盼蓝染色、改良苯酚品红染色；细胞调亡生 化特征的检测：DNA电泳、细胞膜磷脂酰丝荧光 显示、调亡细胞原位末端标记法。
细胞凋亡诱导技术的使用教程
细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。
它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。
本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。
第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。
常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。
确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。
此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。
第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。
不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。
一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。
此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。
不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。
第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。
这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。
一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。
因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。
第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。
常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。
荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。
根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。
第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。
根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。
常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂激素地塞米松T细胞细胞因子IL—2 胸腺细胞TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞IL—10 髓样白血病细胞IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞抗IgD抗体B细胞抗HLA—II抗体静止B细胞超抗原SPE CD4+T细胞胞内信号分子调节剂放线菌酮T细胞PKC激活剂胸腺细胞其他DNA拓扑异构酶抑制剂白血病细胞放射线淋巴样细胞抑制剂细胞因子IL—2 T H1细胞IL—4 T H2细胞IL—10 B、T细胞IFN—ΥT细胞IL—4 B细胞黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞VLA—4、VCAM—1 B细胞胞内信号分子调节剂PKC激活剂T、B细胞细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。
1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。
近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。
细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1．形态学变化：细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段：1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。
2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。
最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。
3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。
上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。
2．细胞凋亡的生化改变：1）胞内Ca2+浓度增高所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。
2）内源性核酸内切酶激活细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤一般包括以下几个步骤：
1. 收集细胞样品：收集需要检测凋亡的细胞样品，可以是培养细胞、动物组织或人体组织。
样品应保持新鲜和完整。
2. 处理细胞样品：根据实验需要，对细胞样品进行处理，例如给予某种刺激物或药物，或者采用特殊培养条件。
3. 准备细胞悬液：将处理后的细胞样品转移到离心管中，并加入适量的培养基或缓冲液，制备细胞悬液。
悬液中细胞应保持单细胞状态。
4. 染色：根据实验要求，选择适当的染料对细胞进行染色。
常用的凋亡染色方法包括荧光染色和酶标法。
5. 流式细胞仪检测：将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪可以检测和分析细胞中的荧光强度或酶标信号，进而评估细胞凋亡程度。
6. 数据分析：根据流式细胞仪检测到的数据，进行数据分析，计算细胞凋亡率或凋亡指数等参数。
08细胞凋亡的诱导及观察
08细胞凋亡的诱导及观察
细胞凋亡是指细胞在细胞生存期内，在不受免疫系统的干预的情况下自身对其进行分解和降解的一种程序，凋亡是一种正常的生理现象，主要由细胞性质决定，这种自毁有助于清除过早的或受损的细胞，维持组织和身体的稳定状态。
诱导凋亡是一种研究细胞凋亡的一种常用方法，它能有效的评估细胞凋亡调节机制，其常用诱导剂有：促凋亡因子如TNF-α、IL-1β、FasL，及抗凋亡因子如Bcl-2等，其观察指标有细胞形态变化、凋亡指标物质的释放、DNA损伤的评估等。
1、细胞形态变化观察
细胞凋亡发生时，细胞形态显著改变，正常细胞多呈圆形，凋亡细胞则会萎缩、溶解、膨大，有凋亡体和细胞质滴落可见。
实验可以采用荧光显微镜或普通显微镜观察细胞形态变化。
2、凋亡特异性指标物质的释放
凋亡特异性指标物质如细胞色素c的释放是细胞凋亡最重要的标志，它是凋亡早期发生的，可以采用流式细胞仪和酶联免疫吸附活性测定法，快速简便的检测出细胞凋亡发生的情况。
3、DNA损伤的评估
DNA损伤是细胞凋亡的标志之一，为此可以采用一种常用的试剂盒TUNEL检测凋亡细胞中DNA的损伤情况，可以观察到受损的DNA片段，及DNA的裂解。
细胞凋亡实验报告
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测一、实验目的学习细胞凋亡诱导及检测。
二、实验原理1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学过程。
与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。
2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。
三、实验材料8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液四、实验步骤1.细胞传代（上一次实验完成）2.凋亡诱导1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。
3. 染色1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜下观察并拍照。
五、实验结果与分析1.观察：实验开始前镜检：细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。
可以看到有的细胞处于裂解状态。
染色后：由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。
视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。
凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。
凋亡前期和中期的细胞较多。
很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。
而且有的细胞在正常光下观察是明显的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。
另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在一起。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代⼈们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡⽅式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增⾼，细胞肿胀，核碎裂，继⽽溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis⼀词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着⽣命⾛到了尽头，细胞到了⼀定时期会像树叶那样⾃然死亡。
凋亡是细胞在⼀定⽣理或病理条件下遵守⾃⾝程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表⾯微绒⽑消失，染⾊质凝集并呈新⽉形或块状靠近核膜边缘，继⽽核裂解，由细胞膜包裹着核碎⽚或其他细胞器形成⼩球状凋亡⼩体凸出于细胞表⾯，最后凋亡⼩体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的⽣化变化特征是核酸内切酶被激活，染⾊体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA⽚段，再进⼀步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸⽚断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素⼲扰等⽅⾯都起着关键性的作⽤。
1．细胞凋亡的检测⽅法凋亡细胞具有⼀些列不同于坏死细胞的形态特征和⽣化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制⼗分复杂，⼀般采⽤多种⽅法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析⽅法有所不同，⽅法选择依赖于具体的研究体系和研究⽬的（表？）。
表凋亡的检测⽅法（引⾃DL 斯佩克特等，2001）⽅法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存⽆限制略带主观性，但可靠Hoechst染⾊不限极快，不能贮存略带主观性，但可靠吖啶橙/溴化⼄锭不限极快，凋亡初期可⽤，略带主观性，但可靠FACS/FSC X SSC ⾮贴壁细胞简单，须及时进⾏客观，仅能提⽰凋亡FACS/PI吸收⾮贴壁细胞简单，需及时进⾏客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋⽩V(锚定蛋⽩) 最好⾮贴壁细胞快速简单；细胞可以被固定并⾮所有细胞在膜整合损失前受PS影响；测定已知的显DNA⽚段（琼脂糖电泳）不限很快、低廉定性，不能确定凋亡；某些细胞不适⽤DNA⽚段(PI染⾊) 不限很快，低廉定量；⽤于估计凋亡程度DNA⽚段(JAM 分析) 循环细胞低廉，可分析多种类混合定量，不能确定凋亡含量；不能⽤于所有细胞TUNEL 不限昂贵，耗时定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价）线粒体膜电位损不限低廉，不能确定凋失快速亡，并⾮次⽣坏死前的所有细胞都适⽤caspase活化(蛋⽩酶活性) 不限中等花⽬前不能确定凋亡，但适⽤于监测器；不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹) 不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases；依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹) 不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定形态学观察⽅法：利⽤各种染⾊法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常⽤的⼀种与DNA结合的荧光染料。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
细胞凋亡实验报告
一、实验背景细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是一种由基因调控的细胞自主性死亡过程。
细胞凋亡在生物体的发育、免疫、代谢等生理过程中具有重要作用。
近年来，细胞凋亡与多种疾病的发生、发展及治疗密切相关，因此，研究细胞凋亡的机制具有重要意义。
本实验旨在通过检测细胞凋亡相关指标，探讨细胞凋亡在特定细胞类型中的作用。
二、实验材料与试剂1. 细胞：实验用细胞为正常细胞系A和肿瘤细胞系B。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、Trizol试剂、DEPC水、无血清培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等。
三、实验方法1. 细胞培养：将正常细胞系A和肿瘤细胞系B分别接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
2. 细胞凋亡检测：将正常细胞系A和肿瘤细胞系B分别分为实验组和对照组。
实验组加入凋亡诱导剂，对照组加入等量无血清培养基。
培养一定时间后，按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书进行细胞凋亡检测。
3. RNA提取：将实验组和对照组细胞收集于离心管中，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。
4. PCR检测：将提取的RNA进行逆转录，得到cDNA。
以cDNA为模板，进行凋亡相关基因的PCR扩增。
5. DNA提取：将实验组和对照组细胞收集于离心管中，按照DNA提取试剂盒说明书提取细胞DNA。
6.琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带。
四、实验结果1. 细胞凋亡检测：实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），说明凋亡诱导剂成功诱导细胞凋亡。
2. RNA提取：成功提取实验组和对照组细胞总RNA。
3. PCR检测：实验组凋亡相关基因表达水平显著高于对照组（P<0.05），说明凋亡诱导剂上调凋亡相关基因表达。
4. 琼脂糖凝胶电泳：实验组凋亡相关基因PCR产物条带较对照组明显，说明凋亡相关基因在实验组中表达上调。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（ph osphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin -Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、P E）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×） 60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml，备用。
2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心103．重复步骤2两次。
检测细胞凋亡的实验方法
检测细胞凋亡的实验方法一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳（一）、检测原理细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
（二）结果判断正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
（一）检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
（二）用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
实验十二凋亡细胞的诱导与光镜下形态观察
4
对照组 细胞膜完整,细胞核呈球形,染色均匀,细胞质均匀透明,从 细胞核大都倚靠边缘可推断液泡依然完整
5
凋亡细胞 细胞核有裂解现象,中间出现空泡,有的呈半月形。出现轻度质壁分离,并
且细胞核大都不再处于边缘,这说明液泡可亡细胞的形态变化 了解一些诱导细胞凋亡的实验方法
1
实验原理
细胞凋亡(apoptosis)是细胞受到内、 外因子刺激后发 生的由基因调控的生理性死亡行为 ,是一个主动和高度有序 的过程。
细胞凋亡对生物体的生长发育有着重要的作用。近年来 ,它 已成为生命科学的热点研究领域 ,并取得许多突破性进展。
2
方法与步骤
本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料 ,以不同 的试剂（比如不同浓度 Ca2 +和 Na+）作为凋 亡诱导剂 ，通过光学显微镜观察洋葱鳞茎内表 皮细胞是否发生了凋亡。
要求：
1.查找资料，设计方案。（采用的药品与浓度） 2.实验 3.观察，统计。 4.论文写作。
3
凋亡的现象：类似动物细胞凋亡的形态学特征 ,即细胞膜皱 缩 ,细胞核固缩 ,核染色质聚集 ,形成凋亡小体等
细胞凋亡检测实验总结
细胞凋亡检测实验总结1.1 AnnexinV/PI双染色法磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将AnnexinV进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
实验方法：XXX细胞直接收集到10mL的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液。
用孵育缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min。
用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
1000r/min 离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
诱导细胞凋亡的实验原理
诱导细胞凋亡的实验原理细胞凋亡是一种重要的生物学过程，指的是由于内外在刺激，细胞主动启动的一系列自我毁灭过程。
这个过程在维持正常生理状态、清除受损细胞及不需要的细胞中起着重要作用。
同时，细胞凋亡的失调也与许多疾病的发生和发展密切相关。
因此，诱导细胞凋亡的实验对于研究细胞凋亡的机制和寻找相关疾病治疗方法起着重要的作用。
诱导细胞凋亡的实验原理主要基于两个方面：一是应用相关刺激物来模拟内外部环境刺激；二是在细胞途径或靶点上进行干预，激活或抑制相关的调控因子，以诱导或抑制细胞凋亡。
在实验中，有许多方法可以诱导细胞凋亡，如使用致死因子、细胞毒物、放射线、细胞因子等刺激物，或通过遗传和分子工程技术产生特定基因改变来诱发细胞凋亡。
致死因子是通过刺激死亡受体（例如TNF受体家族成员如Fas和TNFR1等）而诱导细胞凋亡的一种方法。
将外源性FasL（Fas配体）或TNF-α等因子添加到培养基中，使其与细胞膜上的Fas或TNFR1结合，并通过调控细胞内的相关信号通路（通常是CASPASE通路）来引发细胞凋亡。
细胞毒物是一类可以直接引起细胞死亡的有毒物质，如化疗药物、致突变剂等。
这些物质可以通过直接作用于细胞的DNA或蛋白质来引发一系列的激活信号级联反应，进而导致细胞凋亡。
例如，DNA损伤剂如顺铂可以与DNA结合，形成DNA附加物从而导致DNA损伤，激活ATM/ATR信号通路，最终启动细胞凋亡。
放射线是另一种常用的诱导细胞凋亡的方法。
实验中可以使用X射线、紫外线等辐射源照射细胞，从而引起细胞内一系列的DNA损伤、突变等反应，导致细胞凋亡。
辐射诱导的DNA损伤与细胞凋亡的机制通常通过ROS（活性氧物种）的产生来介导。
细胞因子也可以被用来诱导细胞凋亡。
细胞因子是一类能够在细胞之间传递信号的蛋白质，例如TGF-β、IL-1β等。
细胞因子通常与细胞膜上的受体结合，并通过调控一系列的信号通路来激活或抑制细胞凋亡。
例如，TGF-β可通过活化SMAD信号通路来诱导细胞凋亡。
细胞凋亡诱导剂.doc
细胞凋亡诱导剂在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。
凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。
因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。
Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。
放线菌素D（Actinomycin D）放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。
通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。
是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。
Camptothecin可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。
可抑制Tat介导的HIV-1的转录。
常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。
Cycloheximide是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白质的合成，而多数原核生物则无效。
在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。
通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。
常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。
可诱导多种细胞的凋亡。
Dexamethasone是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。
可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。
在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。
一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时）Etoposide是拓普异构酶II的抑制剂。
是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。
可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。
StaurosporineStaurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激酶）强有力的抑制剂。
细胞生物学实验-细胞凋亡观察
色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小 不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。 ⑤ AO（吖啶橙）和EB（溴化乙锭）双染色：AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入 核DNA呈绿色，EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。显微镜下 观察，活细胞为荧光深浅不一的结构样特征，核染色质为绿色；凋亡细胞染色强， 亮度高，核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 或均匀一致的圆状或固缩团状结构。 ⑥ 透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形， 核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”，同时可以观察到凋亡 小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。
细胞凋亡检测
保留的细胞
不健康的细胞
细胞开 始收缩
细胞崩 溃分解 成碎片
不健康的细胞已被除去， 组织内附近的细胞进行 有丝分裂，合上缺口
细胞凋亡检测
细胞凋亡的诱导试剂：
名称 Actinomycin D
Aphidocolin A23187 Caffeine
Camptothecin Cycloheximide Dexamethasone
溶剂 甲醇 二甲亚砜 二甲亚砜 沸水 二甲亚砜
水 乙醇
水
二甲亚砜， 热水 水
二甲亚砜 二甲亚砜 磷酸盐缓冲液
甲醇
细胞凋亡检测
细胞凋亡的检测方法：
细胞增殖凋亡检验方法
细胞增殖凋亡检验方法细胞增殖和凋亡是细胞生物学中两个重要的过程，对于细胞生长、发育和疾病发展起着关键作用。
因此，研究细胞增殖和凋亡的检验方法对于揭示相关生物学过程以及发现新的治疗靶点具有重要意义。
本文将介绍几种常用的细胞增殖和凋亡检验方法。
一、细胞增殖检验方法1.MTT法MTT法（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一种常见的细胞增殖检验法。
MTT可以在活细胞内还原生成紫色的福尔马因酸化物，通过测定细胞活性来评估细胞增殖情况。
该方法的优点是简便、快速、应用广泛，但只能评估细胞整体增殖情况。
2. Bromodeoxyuridine（BrdU）标记法BrdU标记法是一种侵入法，可以评估细胞的DNA合成和增殖。
细胞在培养基中加入BrdU，细胞会将其代入新合成的DNA链中。
然后，可以使用抗BrdU抗体来检测BrdU标记的细胞。
该方法对于细胞周期和增殖动力学的研究非常有用。
标记法EdU标记法是一种新兴的细胞增殖检验方法。
与BrdU类似，EdU也是一种DNA合成的标记物，但是与BrdU相比，EdU标记更加简单快速。
EdU可以通过与荧光染料的偶联来进行检测，对于多通道染色非常适用。
1. Annexin V-FITC/PI染色法Annexin V-FITC/PI染色法是一种常用的细胞凋亡检验方法。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂酰丝氨酸的结合蛋白，在凋亡过程中会在细胞表面表达。
PI是一种DNA染料，用于区分凋亡和坏死细胞。
该方法可以通过流式细胞术或荧光显微镜来评估细胞的凋亡程度。
2. DNA Laddering检测法DNA Laddering检测法是一种检测凋亡的传统方法。
在细胞凋亡过程中，核酸会被酶切为200-300bp的碎片，形成明显的DNA阶梯状图案。
该方法通过DNA琼脂糖凝胶电泳来检测DNA断裂情况。
3.TUNEL法TUNEL法（dUTP尾部标记法）是一种直接检测DNA断裂的方法。
药物诱导凋亡
实验步骤
6. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是 否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7. 重复操作步骤6。 8. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2
实验步骤
1. 在细胞悬液中加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。 2. 加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，
溶液应变清亮，简短离心以去除水珠。 3. 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能
会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 4. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中
（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g)离 心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 5. 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD （使用前请先检查 是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心 30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
凋亡的细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间，因此 产生的断裂DNA在电泳时会呈180-200bp整数倍大小 的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。 能诱导细胞凋亡的枉法有很多，这里主要采取化疗 药物诱导细胞凋亡
化疗药物诱导细胞凋亡并产生“阶梯”效应
实验材料
HepG2 肝癌细胞株，DNA提取试剂盒， 移液器，EP管，PBS，低温离心机
min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液。 9. 吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位 悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min， 12,000 r心管 中。
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4人分组、加药（每竖排按从前到后的顺序1—8组） 每组6个孔加药，其中2个对照（PBS）
1 A 2 3 4 5 6
1
B
2
C
3
D
4
理论知识
细胞凋亡是由基因控制的程序性的细胞主动死亡
细胞凋亡的形态结构改变过程 .
(apoptotic bodies) 细胞皱缩—— 染色质凝集 —— 凋亡小体形成
(cell shrinkage) (chromatin亡小体形成
（1）凋亡起始
微绒毛消失，线粒体正常，
ER膨胀与质膜融合，染色质固缩、边集
微绒毛消失
染色质固缩、边集
（2）凋亡小体形成
染色质片段化与细胞器一起被反折的膜包围， 出芽形成凋亡小体。
(3) 凋亡小体被吞噬、消化
Macrophage/Phagocyte
诱导细胞凋亡的因子
5.碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测
【实验原理】 正常细胞和凋亡细胞的膜都保持了膜 的完整性，但凋亡细胞核染色质发生高度凝集和缘 化，并形成大小不同被膜包围的凋亡小体，而正常
细胞核染色质均匀分布；坏死细胞膜损伤，染色质
凝集程度远底于凋亡细胞。根据细胞膜功能完整性 和核内染色质发生凝集的特点，用荧光探针碘化丙 啶（PI）和Ho.33342双染方法可以区别凋亡细胞、 坏死细胞和正常细胞。
凋亡细胞
正常细胞
一、细胞凋亡的形态学特征
apoptosis
necrosis
细胞膨胀、ER、Mi、核肿胀 溶酶体膜破坏 细胞溶解
细胞变圆、微绒毛消 失、膜皱缩胞质浓缩， ER扩张与质膜融合， 核浓缩，染色质边集 形成凋亡小体
细胞坏死与程序性细胞死亡比较
细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：
1、凋亡起始
倒置相差显微镜观察
正常肝癌HepG2细胞
形成凋亡小体
3. 吖啶橙（AO）荧光 标本制备：
漂洗 固定
（95％乙醇）
染色
封片
观察
吖啶橙（AO）荧光显示肝癌细胞凋亡小体
4. Giemsa染色
每3人一组，取出一飞片，放入小培养皿，PBS液冲 洗，甲醇固定10min，取出飞片晾干，置载玻片上， Giemsa染色5～10分钟，自来水冲洗，中性树胶封片， 镜下观察细胞凋亡情况。
聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一般只
能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因
为在光镜下某些类型的细胞坏死（如凝固性坏 死）可与细胞凋亡的形态相似。
凋亡小体
普通光学显微镜观察
染色质新月形边集（HE染色）
凋亡小体（HE染色）
2.荧光显微镜
用荧光染料直接对细胞DNA进行染色，或用荧光标记的特
异性探针对细胞进行标记。常用的直接用于细胞染色的荧 光染料有：DAPI、Hoechst33258和 Hoechst33342、PI、EB等。 细胞染色后色彩表现清晰，浓缩部分的荧光亮度明显增
结果
（1）加MTT4小时后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的 MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解。 （2）各组OD值取均值后，以下式计算存活细胞百分数∶
存活细胞%=
OD实验组 OD对照组
×100%
（以空白组OD值调零）
对照组
实验组
细胞凋亡的 诱导及检测
山东大学医学院细胞生物学系 2014年5月
课程安排
本次融合试验共32学时，在“细胞与分子医学教 学平台”实施教学； 细胞生物学、分子生物学、遗传学三个研究所共 同承担授课，每个研究所各分配8学时，总结考 评8学时； 分组：每实验台双面6位同学为一大组，单面3位 同学为一小组。此次划定后一直到实验结束。考 评以大组为单位进行，成绩共享。 考评安排：每大组由一名同学主讲，负责分工和 答辩材料准备。地点在实验室进行。 考评内容与时间：
大蒜素
第1组
2
3
4
剂量 3ul
10ul
25ul
对照组
方法
（3）把各孔中培养基弃去，加入DMEM培养基100μ l，
于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37℃培养4h；
（细胞在SDH作用下把黄色MTT还原成紫兰色结晶）。
（4）吸弃培养液，各孔加入100μ l DMSO，将培养板 振荡10～20分钟，37℃培养10min 。 （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过 与对照组比较得到实验组的存活率。
第一部分
培养细胞凋亡的诱导
凋亡细胞形态学观察
细胞增殖活力检查
◆凋亡诱导：
肝癌细胞HepG2 （1）培养液：10%小牛血清 高糖DMEM;
培养条件：37℃ 5%二氧化碳饱和湿度培养箱
（2）传代：以5×104细胞密度于含有盖玻片的24孔 板， 37℃培养过夜； （3）每孔加入5ml的大蒜素（终浓度为60µg/ml）， 以药物溶剂（PBS）作对照，37 ℃培养1h；
◆物理性因子：包括射线（紫外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 ◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA
和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿
瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等
二、细胞凋亡的形态学检测方法
1. 倒置相差显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩
（药物、紫外线等）
显微结构
超微结构
流式细胞 检测法
四、实验操作方法与步骤
1.凋亡诱导： 2. 光学显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固 缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一 般只能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价 值，因为在光镜 下某些类型的细胞坏死 （如凝固性坏死）可与细胞凋亡的形态相似。
正常细胞
凋亡细胞
6. MTT法检测细胞活力
琥珀酸脱氢酶显示
琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydiogenease) 存在于线粒体内，在有酶存在的部位，酶可 作用于底物进行脱氢，脱下的氢与四唑盐 （如：硝基蓝四唑Nitro-BT、四甲基偶氮唑 盐MTT等）作用，将氧化型的四唑还原成有 色的甲臜。
操作步骤：
（1）取出24孔培养板中的飞片置于培养皿上； （2）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （3）加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光 放置30min（纸盒、封口膜）； （PI使用浓度为50ug/ml，Ho.33342使用浓度为10ug/ml） （4）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （5）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片 上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气 泡，封固后荧光显微镜观察。 （6）荧光显微镜下观察： 在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色 荧光，坏死细胞发桔红色荧光。正常肝癌细胞核荧光均匀， 而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝 色荧光的凋亡小体。
PI（碘化丙啶）是双链核酸的标记物，可嵌入双链 DNA或双链RNA中，PI不能穿过功能完整细胞膜，只能进 入膜有损伤的细胞。在紫外光或绿光激发后，坏死细胞 呈现出很强的桔红色荧光。正常细胞和凋亡细胞膜功能 完好，PI不能进入细胞，故不发红色荧光。 荧光探针Ho.33342是一种特异性DNA标记物，主要结 合于A-T碱基区，由于它的亲脂性，可以进入活细胞中 标记DNA（也可以进入死细胞），因此，对正常细胞、 凋亡细胞和坏死细胞都可以进行标记。在紫外光激发下， 正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞 因PI发出的强桔红色荧光而被遮盖。所以从颜色上很容 易将坏死细胞区分出来；再根据染色质凝集程度和凋亡 小体区分正常细胞与凋亡细胞。
本实验中培养细胞内琥珀酸脱氢酶，使 MTT还原成紫蓝色甲臜，二甲基亚砜可将 甲臜溶解，酶联仪测其光密度得到OD值。 通过OD值可计算不同条件下细胞的存活比 率。此法常用来测试细胞毒作用、癌细胞对 体外放射及化学药物的敏感性、或体外细胞 系筛选有效化疗药物及放射增敏剂等。
方法
设空白组、正常对照组、加药实验组（空白组 除不加细胞外、正常对照组除不加药物外其余均 与加药实验组同样处理） （1）细胞传代∶将贴壁生长的肝癌细胞用0.25%胰 酶消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml,每 孔100μ l传于96孔板A、B、C、D四个排孔内，待 细胞培养至指数生长期时加药。 （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（3、10、25 ml）， 每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，将培养板 放回37℃继续培养0.5h；
强。
3.激光共聚焦显微镜
4. 流式细胞仪（FCM）
◆凋亡检测技术的选择原则
一般选择2~3种检测方法,以相互印证,如形态学
方法可选择荧光或电镜,再加TUNEL、FCM、 DNA片段或caspases等方法 根据凋亡发生的时间顺序,选择适当的检测试剂 和技术
注意检测的时间
三、细胞凋亡研究方法
诱导细胞凋亡 检 测 形态学特征 生物化学特征（DNA含量及降解分析） 琼脂糖电泳法