2014凋亡细胞的诱导及检测--LX
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（药物、紫外线等）
显微结构
超微结构
流式细胞 检测法
Biblioteka Baidu
四、实验操作方法与步骤
1.凋亡诱导： 2. 光学显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固 缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一 般只能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价 值，因为在光镜 下某些类型的细胞坏死 （如凝固性坏死）可与细胞凋亡的形态相似。
5.碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测
【实验原理】 正常细胞和凋亡细胞的膜都保持了膜 的完整性，但凋亡细胞核染色质发生高度凝集和缘 化，并形成大小不同被膜包围的凋亡小体，而正常
细胞核染色质均匀分布；坏死细胞膜损伤，染色质
凝集程度远底于凋亡细胞。根据细胞膜功能完整性 和核内染色质发生凝集的特点，用荧光探针碘化丙 啶（PI）和Ho.33342双染方法可以区别凋亡细胞、 坏死细胞和正常细胞。
聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一般只
能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因
为在光镜下某些类型的细胞坏死（如凝固性坏 死）可与细胞凋亡的形态相似。
凋亡小体
普通光学显微镜观察
染色质新月形边集（HE染色）
凋亡小体（HE染色）
2.荧光显微镜
用荧光染料直接对细胞DNA进行染色，或用荧光标记的特
异性探针对细胞进行标记。常用的直接用于细胞染色的荧 光染料有：DAPI、Hoechst33258和 Hoechst33342、PI、EB等。 细胞染色后色彩表现清晰，浓缩部分的荧光亮度明显增
PI（碘化丙啶）是双链核酸的标记物，可嵌入双链 DNA或双链RNA中，PI不能穿过功能完整细胞膜，只能进 入膜有损伤的细胞。在紫外光或绿光激发后，坏死细胞 呈现出很强的桔红色荧光。正常细胞和凋亡细胞膜功能 完好，PI不能进入细胞，故不发红色荧光。 荧光探针Ho.33342是一种特异性DNA标记物，主要结 合于A-T碱基区，由于它的亲脂性，可以进入活细胞中 标记DNA（也可以进入死细胞），因此，对正常细胞、 凋亡细胞和坏死细胞都可以进行标记。在紫外光激发下， 正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞 因PI发出的强桔红色荧光而被遮盖。所以从颜色上很容 易将坏死细胞区分出来；再根据染色质凝集程度和凋亡 小体区分正常细胞与凋亡细胞。
细胞凋亡的 诱导及检测
山东大学医学院细胞生物学系 2014年5月
课程安排
本次融合试验共32学时，在“细胞与分子医学教 学平台”实施教学； 细胞生物学、分子生物学、遗传学三个研究所共 同承担授课，每个研究所各分配8学时，总结考 评8学时； 分组：每实验台双面6位同学为一大组，单面3位 同学为一小组。此次划定后一直到实验结束。考 评以大组为单位进行，成绩共享。 考评安排：每大组由一名同学主讲，负责分工和 答辩材料准备。地点在实验室进行。 考评内容与时间：
操作步骤：
（1）取出24孔培养板中的飞片置于培养皿上； （2）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （3）加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光 放置30min（纸盒、封口膜）； （PI使用浓度为50ug/ml，Ho.33342使用浓度为10ug/ml） （4）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （5）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片 上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气 泡，封固后荧光显微镜观察。 （6）荧光显微镜下观察： 在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色 荧光，坏死细胞发桔红色荧光。正常肝癌细胞核荧光均匀， 而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝 色荧光的凋亡小体。
倒置相差显微镜观察
正常肝癌HepG2细胞
形成凋亡小体
3. 吖啶橙（AO）荧光 标本制备：
漂洗 固定
（95％乙醇）
染色
封片
观察
吖啶橙（AO）荧光显示肝癌细胞凋亡小体
4. Giemsa染色
每3人一组，取出一飞片，放入小培养皿，PBS液冲 洗，甲醇固定10min，取出飞片晾干，置载玻片上， Giemsa染色5～10分钟，自来水冲洗，中性树胶封片， 镜下观察细胞凋亡情况。
正常细胞
凋亡细胞
6. MTT法检测细胞活力
琥珀酸脱氢酶显示
琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydiogenease) 存在于线粒体内，在有酶存在的部位，酶可 作用于底物进行脱氢，脱下的氢与四唑盐 （如：硝基蓝四唑Nitro-BT、四甲基偶氮唑 盐MTT等）作用，将氧化型的四唑还原成有 色的甲臜。
第一部分
培养细胞凋亡的诱导
凋亡细胞形态学观察
细胞增殖活力检查
◆凋亡诱导：
肝癌细胞HepG2 （1）培养液：10%小牛血清 高糖DMEM;
培养条件：37℃ 5%二氧化碳饱和湿度培养箱
（2）传代：以5×104细胞密度于含有盖玻片的24孔 板， 37℃培养过夜； （3）每孔加入5ml的大蒜素（终浓度为60µg/ml）， 以药物溶剂（PBS）作对照，37 ℃培养1h；
3、凋亡小体被吞噬、消化 2、凋亡小体形成
（1）凋亡起始
微绒毛消失，线粒体正常，
ER膨胀与质膜融合，染色质固缩、边集
微绒毛消失
染色质固缩、边集
（2）凋亡小体形成
染色质片段化与细胞器一起被反折的膜包围， 出芽形成凋亡小体。
(3) 凋亡小体被吞噬、消化
Macrophage/Phagocyte
诱导细胞凋亡的因子
结果
（1）加MTT4小时后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的 MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解。 （2）各组OD值取均值后，以下式计算存活细胞百分数∶
存活细胞%=
OD实验组 OD对照组
×100%
（以空白组OD值调零）
对照组
实验组
大蒜素
第1组
2
3
4
剂量 3ul
10ul
25ul
对照组
方法
（3）把各孔中培养基弃去，加入DMEM培养基100μ l，
于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37℃培养4h；
（细胞在SDH作用下把黄色MTT还原成紫兰色结晶）。
（4）吸弃培养液，各孔加入100μ l DMSO，将培养板 振荡10～20分钟，37℃培养10min 。 （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过 与对照组比较得到实验组的存活率。
◆物理性因子：包括射线（紫外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 ◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA
和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿
瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等
二、细胞凋亡的形态学检测方法
1. 倒置相差显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩
4人分组、加药（每竖排按从前到后的顺序1—8组） 每组6个孔加药，其中2个对照（PBS）
1 A 2 3 4 5 6
1
B
2
C
3
D
4
理论知识
细胞凋亡是由基因控制的程序性的细胞主动死亡
细胞凋亡的形态结构改变过程 .
(apoptotic bodies) 细胞皱缩—— 染色质凝集 —— 凋亡小体形成
(cell shrinkage) (chromatin condensation)
强。
3.激光共聚焦显微镜
4. 流式细胞仪（FCM）
◆凋亡检测技术的选择原则
一般选择2~3种检测方法,以相互印证,如形态学
方法可选择荧光或电镜,再加TUNEL、FCM、 DNA片段或caspases等方法 根据凋亡发生的时间顺序,选择适当的检测试剂 和技术
注意检测的时间
三、细胞凋亡研究方法
诱导细胞凋亡 检 测 形态学特征 生物化学特征（DNA含量及降解分析） 琼脂糖电泳法
凋亡细胞
正常细胞
一、细胞凋亡的形态学特征
apoptosis
necrosis
细胞膨胀、ER、Mi、核肿胀 溶酶体膜破坏 细胞溶解
细胞变圆、微绒毛消 失、膜皱缩胞质浓缩， ER扩张与质膜融合， 核浓缩，染色质边集 形成凋亡小体
细胞坏死与程序性细胞死亡比较
细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：
1、凋亡起始
本实验中培养细胞内琥珀酸脱氢酶，使 MTT还原成紫蓝色甲臜，二甲基亚砜可将 甲臜溶解，酶联仪测其光密度得到OD值。 通过OD值可计算不同条件下细胞的存活比 率。此法常用来测试细胞毒作用、癌细胞对 体外放射及化学药物的敏感性、或体外细胞 系筛选有效化疗药物及放射增敏剂等。
方法
设空白组、正常对照组、加药实验组（空白组 除不加细胞外、正常对照组除不加药物外其余均 与加药实验组同样处理） （1）细胞传代∶将贴壁生长的肝癌细胞用0.25%胰 酶消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml,每 孔100μ l传于96孔板A、B、C、D四个排孔内，待 细胞培养至指数生长期时加药。 （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（3、10、25 ml）， 每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，将培养板 放回37℃继续培养0.5h；
显微结构
超微结构
流式细胞 检测法
Biblioteka Baidu
四、实验操作方法与步骤
1.凋亡诱导： 2. 光学显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固 缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一 般只能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价 值，因为在光镜 下某些类型的细胞坏死 （如凝固性坏死）可与细胞凋亡的形态相似。
5.碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测
【实验原理】 正常细胞和凋亡细胞的膜都保持了膜 的完整性，但凋亡细胞核染色质发生高度凝集和缘 化，并形成大小不同被膜包围的凋亡小体，而正常
细胞核染色质均匀分布；坏死细胞膜损伤，染色质
凝集程度远底于凋亡细胞。根据细胞膜功能完整性 和核内染色质发生凝集的特点，用荧光探针碘化丙 啶（PI）和Ho.33342双染方法可以区别凋亡细胞、 坏死细胞和正常细胞。
聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一般只
能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因
为在光镜下某些类型的细胞坏死（如凝固性坏 死）可与细胞凋亡的形态相似。
凋亡小体
普通光学显微镜观察
染色质新月形边集（HE染色）
凋亡小体（HE染色）
2.荧光显微镜
用荧光染料直接对细胞DNA进行染色，或用荧光标记的特
异性探针对细胞进行标记。常用的直接用于细胞染色的荧 光染料有：DAPI、Hoechst33258和 Hoechst33342、PI、EB等。 细胞染色后色彩表现清晰，浓缩部分的荧光亮度明显增
PI（碘化丙啶）是双链核酸的标记物，可嵌入双链 DNA或双链RNA中，PI不能穿过功能完整细胞膜，只能进 入膜有损伤的细胞。在紫外光或绿光激发后，坏死细胞 呈现出很强的桔红色荧光。正常细胞和凋亡细胞膜功能 完好，PI不能进入细胞，故不发红色荧光。 荧光探针Ho.33342是一种特异性DNA标记物，主要结 合于A-T碱基区，由于它的亲脂性，可以进入活细胞中 标记DNA（也可以进入死细胞），因此，对正常细胞、 凋亡细胞和坏死细胞都可以进行标记。在紫外光激发下， 正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞 因PI发出的强桔红色荧光而被遮盖。所以从颜色上很容 易将坏死细胞区分出来；再根据染色质凝集程度和凋亡 小体区分正常细胞与凋亡细胞。
细胞凋亡的 诱导及检测
山东大学医学院细胞生物学系 2014年5月
课程安排
本次融合试验共32学时，在“细胞与分子医学教 学平台”实施教学； 细胞生物学、分子生物学、遗传学三个研究所共 同承担授课，每个研究所各分配8学时，总结考 评8学时； 分组：每实验台双面6位同学为一大组，单面3位 同学为一小组。此次划定后一直到实验结束。考 评以大组为单位进行，成绩共享。 考评安排：每大组由一名同学主讲，负责分工和 答辩材料准备。地点在实验室进行。 考评内容与时间：
操作步骤：
（1）取出24孔培养板中的飞片置于培养皿上； （2）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （3）加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光 放置30min（纸盒、封口膜）； （PI使用浓度为50ug/ml，Ho.33342使用浓度为10ug/ml） （4）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （5）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片 上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气 泡，封固后荧光显微镜观察。 （6）荧光显微镜下观察： 在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色 荧光，坏死细胞发桔红色荧光。正常肝癌细胞核荧光均匀， 而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝 色荧光的凋亡小体。
倒置相差显微镜观察
正常肝癌HepG2细胞
形成凋亡小体
3. 吖啶橙（AO）荧光 标本制备：
漂洗 固定
（95％乙醇）
染色
封片
观察
吖啶橙（AO）荧光显示肝癌细胞凋亡小体
4. Giemsa染色
每3人一组，取出一飞片，放入小培养皿，PBS液冲 洗，甲醇固定10min，取出飞片晾干，置载玻片上， Giemsa染色5～10分钟，自来水冲洗，中性树胶封片， 镜下观察细胞凋亡情况。
正常细胞
凋亡细胞
6. MTT法检测细胞活力
琥珀酸脱氢酶显示
琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydiogenease) 存在于线粒体内，在有酶存在的部位，酶可 作用于底物进行脱氢，脱下的氢与四唑盐 （如：硝基蓝四唑Nitro-BT、四甲基偶氮唑 盐MTT等）作用，将氧化型的四唑还原成有 色的甲臜。
第一部分
培养细胞凋亡的诱导
凋亡细胞形态学观察
细胞增殖活力检查
◆凋亡诱导：
肝癌细胞HepG2 （1）培养液：10%小牛血清 高糖DMEM;
培养条件：37℃ 5%二氧化碳饱和湿度培养箱
（2）传代：以5×104细胞密度于含有盖玻片的24孔 板， 37℃培养过夜； （3）每孔加入5ml的大蒜素（终浓度为60µg/ml）， 以药物溶剂（PBS）作对照，37 ℃培养1h；
3、凋亡小体被吞噬、消化 2、凋亡小体形成
（1）凋亡起始
微绒毛消失，线粒体正常，
ER膨胀与质膜融合，染色质固缩、边集
微绒毛消失
染色质固缩、边集
（2）凋亡小体形成
染色质片段化与细胞器一起被反折的膜包围， 出芽形成凋亡小体。
(3) 凋亡小体被吞噬、消化
Macrophage/Phagocyte
诱导细胞凋亡的因子
结果
（1）加MTT4小时后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的 MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解。 （2）各组OD值取均值后，以下式计算存活细胞百分数∶
存活细胞%=
OD实验组 OD对照组
×100%
（以空白组OD值调零）
对照组
实验组
大蒜素
第1组
2
3
4
剂量 3ul
10ul
25ul
对照组
方法
（3）把各孔中培养基弃去，加入DMEM培养基100μ l，
于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37℃培养4h；
（细胞在SDH作用下把黄色MTT还原成紫兰色结晶）。
（4）吸弃培养液，各孔加入100μ l DMSO，将培养板 振荡10～20分钟，37℃培养10min 。 （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过 与对照组比较得到实验组的存活率。
◆物理性因子：包括射线（紫外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 ◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA
和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿
瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等
二、细胞凋亡的形态学检测方法
1. 倒置相差显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩
4人分组、加药（每竖排按从前到后的顺序1—8组） 每组6个孔加药，其中2个对照（PBS）
1 A 2 3 4 5 6
1
B
2
C
3
D
4
理论知识
细胞凋亡是由基因控制的程序性的细胞主动死亡
细胞凋亡的形态结构改变过程 .
(apoptotic bodies) 细胞皱缩—— 染色质凝集 —— 凋亡小体形成
(cell shrinkage) (chromatin condensation)
强。
3.激光共聚焦显微镜
4. 流式细胞仪（FCM）
◆凋亡检测技术的选择原则
一般选择2~3种检测方法,以相互印证,如形态学
方法可选择荧光或电镜,再加TUNEL、FCM、 DNA片段或caspases等方法 根据凋亡发生的时间顺序,选择适当的检测试剂 和技术
注意检测的时间
三、细胞凋亡研究方法
诱导细胞凋亡 检 测 形态学特征 生物化学特征（DNA含量及降解分析） 琼脂糖电泳法
凋亡细胞
正常细胞
一、细胞凋亡的形态学特征
apoptosis
necrosis
细胞膨胀、ER、Mi、核肿胀 溶酶体膜破坏 细胞溶解
细胞变圆、微绒毛消 失、膜皱缩胞质浓缩， ER扩张与质膜融合， 核浓缩，染色质边集 形成凋亡小体
细胞坏死与程序性细胞死亡比较
细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：
1、凋亡起始
本实验中培养细胞内琥珀酸脱氢酶，使 MTT还原成紫蓝色甲臜，二甲基亚砜可将 甲臜溶解，酶联仪测其光密度得到OD值。 通过OD值可计算不同条件下细胞的存活比 率。此法常用来测试细胞毒作用、癌细胞对 体外放射及化学药物的敏感性、或体外细胞 系筛选有效化疗药物及放射增敏剂等。
方法
设空白组、正常对照组、加药实验组（空白组 除不加细胞外、正常对照组除不加药物外其余均 与加药实验组同样处理） （1）细胞传代∶将贴壁生长的肝癌细胞用0.25%胰 酶消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml,每 孔100μ l传于96孔板A、B、C、D四个排孔内，待 细胞培养至指数生长期时加药。 （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（3、10、25 ml）， 每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，将培养板 放回37℃继续培养0.5h；