表达蛋白的生物学活性的检测
TGF_R_Fc融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定
文章编号:1007-8738(2003)04-400-04TGF 2βR Ⅱ/Fc 融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定李圣青1,李焕章1,杨乔欣2,倪殿涛1(第四军医大学1西京医院呼吸内科,2基础部微生物学教研室,陕西西安710032)收稿日期:2002-12-23; 修回日期:2003-03-27作者简介:李圣青(19702),女,安徽芜湖人,博士生.Tel.(029)3375237/3373682Purif ication and characterization of thef usion protein TGF 2βR Ⅱ/FcL I S heng 2qi ng 1,L I Huan 2z hang 1,Y ang Qiao 2xi n 2,N I Dian 2tao11Department of Respiration ,Xijing Hospital ,2Department of Mi 2crobiology ,Fourth Military Medical University ,Xi ’an 710032,ChinaAbstractAIM :T o expre ss the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc in largeamounts by using recombinant Bac 2TR Ⅱbaculovirus expre ssion system constructed by our laboratory and to purify and charac 2terize it.Then ,to verify whether the fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can be able to block the biological activity of cytokine TGF 2β1.METH ODS :The viral titer was determined by plaque form 2ing te st.The recombinant baculovirus was amplified by in fecting sf9cells.The fusion protein was purified by FPLC using protein G column.The purified product was analyzed by SDS 2PAGE and the amount of target protein calculated by gray scanning.We st 2ern blot and sandwich E LISA were used to affirm the expre ssion of the fusion protein.MTT colorimetry was used to te st whetherthe fusion protein can block the inhibition effect of cytokine TG F 2β1on the growth of L929cells.I t was to verify whether the fusion protein can reduce the fibronectin production in L929cells ac 2celerated by TGF 2β1by we stern blot.RESU LTS :The titer ofrecombinant Bac 2TR Ⅱbaculavirus in the primary culture fluid was 2×1012pfu/L.A fter electrophore sis ,gray scanning analy 2sis showed that the target protein accounted for 10percent of the total protein.We stern blot analysis and sandwich E LISA de 2tection proved that the target protein has been expre ssed.The fusion protein could block the inhibitive effect of cytokine TGF 2β1on the growth of L929cells and fibronectin production in L929cells.CONC L USION :The fusion protein TGF 2βR Ⅱ/Fc can in 2hibit the biological activity of TGF 2β1in vitro.This study will behelpful to the mass production of the fusion protein ,and will fa 2cilitate its further use in the therapy of pulmonary fibrosis.K eyw ords :transforming growth factor 2beta ;pulmonary fibrosis ;fusion protein摘要目的:用重组Bac 2TR Ⅱ杆状病毒表达系统大量表达融合蛋白TGF 2βR Ⅱ/Fc ,并对其进行纯化及鉴定;验证该融合蛋白是否能够阻断细胞因子TGF 2β1的生物学作用。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。
牛IL18成熟蛋白基因的表达及生物学活性测定
培养
取培养上清检测ELISA抗体 OD450值 P/N≥2.1为阳性
结果判定
结 果（一）
重组表达质粒的鉴定
1，2： pGEX6p-1-BoIL-18 经 Sal I、Not I 双酶切 3：PGEX6P-1的空载体经Sal I、 Not I 双酶切 4：DL2000 marker 5：pGEX6p-1-BoIL-18的PCR 扩增 6：PGEX6p-1的PCR扩增
• 研究表明,IL-18能诱导产生IFN-γ 。人类医学 研究已经证明了IL-18在抗微生物感染,尤其是 在抗肿瘤免疫方面具有潜在的应用价值。
研究现状
• 牛白细胞介素18（ Bovine Interleukin-18 , BoIL-18）的研究相对滞后，1999年, shoda等 首次获得了BoIL-18基因。 • 目前，国内对BoIL-18的研究还属于起步阶段, 但不容否认的是，BoIL-18的基因及其编码蛋 白在免疫学研究以及奶牛疾病防治中具有重要 意义, 有望成为一种新型生物制剂。
• 细胞因子(cytokines)是强有力的蛋白性调 节因子,可以调节免疫反应、炎症反应、组 织修复、组织移植和造血等。
• 近年来，重组细胞因子已在一些动物疾病预 防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等方 面显示出了广阔的应用前景
研究的目的意义（二）
• 白细胞介素18（ Interleukin-18 , IL-18）是近 年发现的一种多功能免疫调节蛋白,它在先天 及后天的免疫应答调节中起重要作用。
小结
• 成功地构建了能高效表达BoIL-18成熟蛋 白基因的重组表达质粒
• 表达的BoIL-18融合蛋白具有增强淋巴细 胞增殖、促进IFN-γ产生的作用
试 验 二 BoIL-18成熟蛋白基因 在昆虫杆状病毒表达载体中的表达及 生物学活性测定
蛋白活性的检测原理和方法
蛋白活性的检测原理和方法蛋白活性是指蛋白质分子在生物体内发挥其生物学功能时所具有的活性特征。
蛋白活性的检测是生命科学和生物技术研究中的一个重要内容，可以帮助科研人员了解蛋白质的结构和功能，并为蛋白质的研究、开发和应用提供有价值的参考。
在蛋白活性检测中，常用的原理和方法包括理化性质法、酶活性法、配体结合法、抗原抗体相互作用法、细胞功能法等。
下面将对这几种常用方法进行详细介绍。
1. 理化性质法理化性质法是一种通过测定蛋白质的物理化学性质来评估蛋白活性的方法。
其中包括紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱、静态光散射、动态光散射等技术。
这些方法可以通过测量蛋白质在不同波长的光吸收或发射光强度来确定其构象、稳定性、聚合状态等物理化学特性，进而推断蛋白质的活性。
2. 酶活性法酶活性法是通过测定蛋白质酶活性的方法来评估其活性。
常用的酶活性检测方法包括酶促反应动力学法、酶电极法、酶标记法等。
其中，酶促反应动力学法是通过测定酶底物的转化速率来评估酶的活性；酶电极法是通过测量酶底物和产物间的电势差或电流变化来评估酶的活性；酶标记法是通过将蛋白质与酶标记物结合，然后测定酶标记物的信号来评估蛋白质的活性。
3. 配体结合法配体结合法是一种通过测定蛋白质与配体之间的相互作用来评估蛋白活性的方法。
其中包括荧光标记法、放射性标记法、表面等温滴定法等技术。
这些方法利用配体与蛋白质结合后形成的复合物具有不同的性质，如荧光强度、放射性强度等，通过测定这些性质的变化来评估蛋白质的活性。
4. 抗原抗体相互作用法抗原抗体相互作用法是一种通过测定蛋白质与抗体之间的结合来评估蛋白活性的方法。
最常用的技术是酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），该方法通过将抗原与抗体结合后，用酶标记的二抗对抗体进行检测，通过测定酶标记物的信号来评估蛋白质的活性。
5. 细胞功能法细胞功能法是一种通过测定蛋白质所调控的细胞功能来评估其活性的方法。
人脂联素基因的原核表达_纯化及活性检测
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９人脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含子。
该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。
脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的０．０１％［１］。
目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２］。
脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。
１材料与方法１．１材料大肠杆菌ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤ１８－Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。
质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。
Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｒｏｍｅｇａ产品。
兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ为北京中杉公司产品。
蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。
蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｒｌｉｎｇ先生馈赠。
异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ），二硫苏糖醇（ＤＴＴ）等均为进口或国产分析纯试剂。
１．２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫瘤切除术且无代谢性疾病者，提取总ＲＮＡ。
将１μｇ总ＲＮＡ，７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５μＬ逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。
方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆入ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达脂联素融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖－６－磷酸酶转录水平的影响。
3C蛋白酶的表达纯化及活性鉴定技术概述
3C蛋白酶的表达纯化及活性鉴定技术概述作者：刘宗文李森雍德祥来源：《科学与信息化》2017年第08期摘要为获得一种新的基因工程工具酶，通过基因合成的方法获得3C蛋白酶基因并将其克隆入表达载体pGEX-4T-1中构建表达载体pGEX-4T-3C，转化大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。
表达产物经GST柱纯化后获得目的蛋白，于4℃条件下对融合蛋白TY50进行切割以鉴定活性。
结果表明3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定高效的表达，经过GST柱纯化纯度达95%以上。
酶切结果表明，获得的3C蛋白酶能够切割含有3C酶切位点的融合蛋白，因此成功开发出一种新的基因工程工具酶。
关键词蛋白酶；工具酶；基因工程1 导言蛋白酶是切割小RNA病毒科非结构蛋白的关键酶，在病毒复制过程中起重要作用。
人鼻病毒3C蛋白酶具有高度酶切特异性，识别位点为Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln Gly-Pro{Matthews， 1994 #1}，能特应性地切割Gln-Gly之间的肽键[1， 2]，人鼻病毒3C蛋白酶全长546 bp左右[3]，编码的蛋白质相对分子质量约为19997。
鉴于此特异性，本研究通过基因工程方法构建重组3C蛋白酶以开发一种新型的工具酶，丰富本公司产品类型。
利用NCBI数据库查找人鼻病毒3C蛋白酶的氨基酸序列[4]，通过本公司的生物工具网站将其优化为适用于大肠杆菌表达的基因序列，直接合成并整合到表达载体中，表达并纯化获得高纯度的3C蛋白酶。
该蛋白酶能特应性地切割含3C蛋白酶切位点的融合蛋白，具有良好的生物学活性，为开发新的基因工程工具酶奠定了良好的基础。
2 材料与方法2.1 与菌株宿主菌大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）及表达载体pGEX-4T-1为本公司自存。
2.2 试剂限制性内切酶为NEB（北京）有限公司产品；DNA聚合酶为本公司自产；胶回收及质粒小抽试剂盒为AXYGEN产品；Glutathione Sepharose 4B购自GE公司；T4 DNA连接酶购自Thermo公司。
蛋白酶体的检测方法
蛋白酶体的检测方法
蛋白酶体是细胞内的重要器官，它在细胞内起着分解和降解蛋
白质的作用。
检测蛋白酶体的活性对于研究细胞的生物学功能和疾
病的发生具有重要意义。
目前，有多种方法可以用于检测蛋白酶体
的活性，以下是其中一些常用的方法：
1. 荧光显微镜观察，荧光显微镜可以观察蛋白酶体的形态和分布，结合荧光标记的蛋白质底物，可以直接观察蛋白酶体的活性和
分解过程。
2. 蛋白酶体活性检测试剂盒，商业化的蛋白酶体活性检测试剂
盒可以通过荧光或发光信号来检测蛋白酶体的活性，这些试剂盒通
常包含底物和检测试剂，操作简便，适用于高通量筛选和实验室研究。
3. 蛋白酶体特异性抑制剂，通过使用特异性的蛋白酶体抑制剂，可以抑制蛋白酶体的活性，从而间接检测蛋白酶体的功能。
4. 免疫印迹分析，利用特异性抗体对蛋白酶体相关蛋白进行免
疫印迹分析，可以检测蛋白酶体的相关蛋白表达水平，间接反映蛋
白酶体的活性。
总的来说，蛋白酶体的检测方法多种多样，可以根据实验需要选择合适的方法进行检测。
这些方法的应用可以帮助研究人员更好地理解蛋白酶体在细胞内的功能和调控机制，为相关疾病的研究和治疗提供重要的参考。
蛋白表达概述
未来研究方向与挑战
蛋白表达调控是一个复杂的过程，涉及多个层面和因素，需要深入研究其机制和 调控规律。
未来需要解决如何实现高效、特异和可控的蛋白表达，以及如何将蛋白表达技术 应用于临床治疗等挑战。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种将抗原-抗体反应与酶催化反应相结合的方法。 通过将酶连接到抗体上，利用酶的催化作用放大信号，提高检测的灵敏度和特异性。 该方法广泛应用于各种蛋白质、激素和病毒抗原的检测。
04
蛋白表达的应用
疾病诊断与治疗
疾病标志物检测
通过检测特定蛋白的表达水平， 有助于早期发现和诊断疾病，如 癌症、心血管疾病等。
05
蛋白表达的前景与展望
基因编辑技术对蛋白表达的影响
基因编辑技术如CRISPR-Cas9为蛋 白表达提供了强大的工具，可以精确 地编辑基因，从而调控蛋白的表达。
随着基因编辑技术的不断完善和优化 ，未来将有更多复杂的基因调控策略 应用于蛋白表达，以满足各种生物医 学需求。
蛋白质组学的发展前景
蛋白质组学作为研究蛋白质表达、功 能和相互作用的学科，在生物医学领 域具有广阔的应用前景。
02
03
翻译终止
起始密码子是翻译的起始点，核 糖体在这里与mRNA结合，并招 募翻译所需的氨基酸。
核糖体沿着mRNA移动，将氨基 酸按照密码子的顺序连接成肽链。
终止密码子使核糖体释放合成的 肽链，并从mRNA上解离。
翻译后修饰
磷酸化
01
磷酸化是指在蛋白激酶的作用下，将磷酸基团转移到蛋白质的
特定氨基酸残基上。
通过调节基因的转录效率和起始位点， 控制mRNA的合成量。
常见的蛋白检测方法
常见的蛋白检测方法蛋白质是生物体内基本的组成部分，对于研究生物体的生理、病理过程具有重要意义。
因此，准确、快速地测量蛋白质的含量和活性是生物学研究的基础之一。
本文将介绍几种常见的蛋白检测方法，包括光度法、比色法、核酸杂交、免疫层析、质谱法以及流式细胞术。
一、光度法光度法是一种常见且简单的蛋白检测方法。
通过测量可见光或紫外光通过溶液时的吸光度来确定蛋白质的浓度。
这种方法的原理是蛋白质分子中存在芳香族氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）能够吸收紫外光。
常用的测定波长是280纳米，此时酪氨酸和色氨酸对紫外光的吸收最大。
光度法需要注意的问题是，其他物质可能会干扰吸光度的测定，因此需要选择适当的波长和合适的标准曲线进行校正。
二、比色法比色法也是一种常见的蛋白检测方法。
它利用蛋白质与某些特定化学试剂反应，生成有颜色的复合物，然后根据复合物的光吸收特性来确定蛋白质的浓度。
常用的比色试剂有Bradford试剂、Lowry试剂和BCA试剂等。
这些试剂能与蛋白质反应产生蓝色或紫色的复合物，在适当的波长下测量其光吸收度，从而得出蛋白质的浓度。
比色法的优点是灵敏度高，适用范围广，但也存在可能受到其他溶液成分的干扰的问题。
三、核酸杂交核酸杂交是一种常用的蛋白检测方法，特别适用于检测蛋白质与核酸的相互作用。
这种方法基于DNA和RNA的互补配对原理，可以通过与特定的DNA或RNA探针杂交，来检测特定蛋白质的存在。
常见的核酸杂交方法有Northern blotting和Southern blotting等。
这些方法需要先将样品中的蛋白质转化为核酸序列，然后与互补的DNA或RNA序列进行杂交，通过检测杂交物的存在来确定蛋白质的浓度。
四、免疫层析免疫层析是一种常用的蛋白检测方法，利用抗体与蛋白质的特异性结合来实现检测。
这种方法需要先制备对目标蛋白质具有特异性的抗体，然后将样品与这种抗体进行反应，形成抗原-抗体复合物。
通过抗原-抗体复合物的特定结构来检测蛋白质的存在。
重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定
Ｓｅ ｇ ｎ Ｈ ｎＰ ｉ ｅ， ｈ ａ ｉ ｅ ａ． ｅａｔ ｅ ｔｆＮ ｃ ａ ｄｃｎ， ｎｔｕ ａ ｉｉｎＭｅ ｉ ｎ， ｈｎｓ Ａ ａ ｅ ｙ ｈｎｆ ， ａ ｅ ｈ ｎ ＭｕＣ ｕｎ ｅ ｔ １Ｄ ｐ ｒ ｎ ｕ ｌ ｒ ｅ ｚ ｊ， ｍ ｏ ｅ Ｍｅ ｉ ｅ Ｉｓｔｔ ｏ ｄ￣ ｏ ｄｃ ｅ Ｃ ｉｅｅ ｃｄ ｍ ｉ ｉ ｅ ｆＲ ｉ ｆ ｄｃ ｉ ｃｓ Ｔａ ｉ ３０ ９ ｏ Ｍｅ ｉ ｌ ｃ ｎ ｅ， ｉ ｊ ０ １２ ａＳｅ ｎ ｎ
小 鼠脂肪组织脂联
素 基 因 的 编码 序 列 ，３ ３ ７位 点 上 的碱 基 Ａ被 Ｇ 置 换 ， 致 在 １３位 的 蛋 氨 酸 被 缬 氨 酸 取 代 。序 列 测定 表 明 ， 建 的 重 组 表 导 １ 构
达 载体 ａｉｏｅｔ ／Ｅ ３ ａ序 列 完 全 正 确 ， 导 工 程 菌 主 要 表 达 可 溶 性 的 融 合 蛋 白 ａ ｉ ｎ ｃ ｎ ， 分 以包 含 体 形 式 表 ｄ ｎｃｉ ｐ Ｔ ２ ｐ ｎ 诱 ｄｐ ｅｔ 一 ｏ ｉ 部
达 。 达 产物 的相 对 分 子 量 （ ） 表 胁 同预 期 分 子量 相 同 ，ｄ ｏｅｔ — Ⅸ 胁 为 ４ ０ ，Ⅸ 胁 为 １ ０ 。 低 浓 度 时 融 合 蛋 白 ａ ｉ ｎｃｉ Ｔ ｐ ｎ ３０ ０Ｔ ９０ ０ 在
刺 激 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 增殖 。结 论 小 鼠脂 肪 组 织 脂 联 素 基 因 编 码 序 列 与 来 自 ３ ３ Ｌ 脂 肪 细 胞 的编 码 序 列 不 同 。成 功 Ｔ一１
将 目 的 序 列 （ ８ ２ ７氨 基 酸 ） 克 隆 至 ｐ Ｔ ３ ａ 表 达 载 体 ， 组 质 粒 ａｉｏ ｅｔ／Ｅ ３ （ 的 序 列 经 测 序 证 实 。 将 １ ～４ 亚 Ｅ 一 ２（） 重 ｄｐｎ ｃ ｎ Ｔ ２ａ ｉｐ ） ａｉｏ ｅｔ ／Ｅ ３ （ 转 化 表达 宿 主 菌 Ｏｉａ ｉ （Ｅ ）在 ２ ℃ 以 １ ｍｏ ＬＩＴ （ 丙 基 一 一 ～ 代 半 乳 糖 苷 ） 导 表 达 目的 ｄｐｎ ｃｎｐ Ｔ ２ａ ｉ ） ｒ ｍ Ｔ Ｄ ３， ７ ｇ Ｍ ｍ ｌ Ｇ异 ／ Ｐ ３ １Ｄ 硫 诱
融合蛋白分析实验报告
一、实验目的本研究旨在分析融合蛋白的表达、纯化及其生物学活性，为后续研究融合蛋白的应用提供基础数据。
二、实验材料1. 融合蛋白表达载体：pET-28a（含目的基因融合蛋白）2. 菌株：BL21（DE3）大肠杆菌3. 试剂：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、DNase I、蛋白酶K、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western Blot试剂盒、小鼠抗目的蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗等4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Western Blot系统、紫外分光光度计等三、实验方法1. 融合蛋白表达将pET-28a表达载体转化至BL21（DE3）大肠杆菌中，挑选阳性克隆，在含IPTG 的LB培养基中培养至对数生长期，诱导表达融合蛋白。
2. 融合蛋白纯化收集诱导后的菌体，进行超声破碎，离心收集上清。
使用Ni柱亲和纯化上清中的融合蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。
3. 融合蛋白鉴定将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白条带。
使用Western Blot方法，将融合蛋白与小鼠抗目的蛋白单克隆抗体进行反应，检测目的蛋白的表达。
4. 融合蛋白生物学活性检测通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测融合蛋白的生物学活性。
四、实验结果1. 融合蛋白表达在IPTG诱导下，目的蛋白在BL21（DE3）大肠杆菌中成功表达，分子量约为50kDa，与预期相符。
2. 融合蛋白纯化使用Ni柱亲和纯化目的蛋白，纯度达到90%以上。
3. 融合蛋白鉴定SDS-PAGE电泳结果显示，目的蛋白条带清晰，与预期分子量相符。
Western Blot检测结果进一步验证了目的蛋白的表达。
4. 融合蛋白生物学活性检测ELISA实验结果显示，融合蛋白具有生物学活性。
五、实验讨论1. 融合蛋白表达本研究成功在BL21（DE3）大肠杆菌中表达了目的蛋白，表达水平较高，为后续研究提供了丰富的蛋白材料。
蛋白过表达的实验设计方案
蛋白过表达的实验设计方案一、引言蛋白过表达是生物学研究中常用的一种技术手段，通过增加特定基因产物的数量，进而研究该蛋白在细胞或生物体中的功能及其与其他生物分子的相互作用。
过表达实验能够揭示蛋白质的功能特性、调控网络、信号通路等重要信息，对于解析生命活动的奥秘具有重要意义。
本文将详细介绍一种蛋白过表达的实验设计方案，包括实验目的、实验原理、实验步骤、预期结果及数据分析等方面。
二、实验目的本实验旨在通过构建蛋白过表达载体，将目标基因导入真核细胞，实现目标蛋白的过表达。
通过检测过表达蛋白的生物学活性，探究其在细胞内的功能及调控机制。
同时，本实验还将评估过表达对细胞生长、代谢等方面的影响，为深入了解蛋白质功能提供实验依据。
三、实验原理蛋白过表达实验主要基于基因克隆和转染技术。
首先，从含有目标基因的基因组或cDNA文库中扩增出目标基因片段，然后将其插入到适当的表达载体中。
表达载体通常包含启动子、增强子、选择标记等元件，以确保目标基因在宿主细胞中的高效表达。
接下来，将构建好的表达载体转染到真核细胞中，通过选择标记筛选出成功转染的细胞。
最后，检测过表达蛋白的表达水平和生物学活性，分析其在细胞内的功能。
四、实验步骤1. 基因扩增：根据目标基因的序列信息，设计特异性引物，从基因组或cDNA文库中扩增出目标基因片段。
PCR反应条件需根据引物和模板的特性进行优化。
2. 表达载体构建：将扩增得到的目标基因片段与表达载体进行连接，构建重组质粒。
连接反应可采用同源重组或限制性内切酶连接等方法。
表达载体的选择需根据实验需求和宿主细胞的特性来确定。
3. 重组质粒鉴定：通过PCR、酶切或测序等方法鉴定重组质粒的正确性。
确保目标基因已正确插入到表达载体中，且无突变或缺失。
4. 细胞转染：将构建好的重组质粒转染到真核细胞中。
转染方法可根据宿主细胞的类型选择，如脂质体转染、电穿孔法、病毒载体介导的转染等。
转染时需设置对照组，以评估转染效率和表达水平。
met常见检测方法
met常见检测方法概述met（细胞外基质金属蛋白酶）是一类重要的酶，它参与了许多生物学过程，如细胞迁移、组织重塑和炎症反应等。
因此，研究和检测met的活性和表达水平对于理解疾病的发生和发展具有重要意义。
本文将介绍一些常见的met检测方法，包括免疫组织化学、免疫印迹、酶活性测定和分子生物学技术等。
免疫组织化学免疫组织化学是一种常见的met检测方法，它可以通过使用特异性的抗体来检测met在组织或细胞中的表达水平。
该方法的原理是将样品固定、切片并与特定的抗体反应，然后使用染色剂将目标蛋白可视化。
通过观察染色结果的强度和分布，可以评估met的表达水平和细胞定位。
免疫印迹免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，也可以用于检测met的表达水平。
该方法基于免疫反应原理，通过将蛋白样品分离、转移到膜上，并与特异性抗体反应，然后使用荧光标记的二抗或酶标记的二抗进行可视化。
通过观察蛋白条带的强度和大小，可以确定met的表达水平。
酶活性测定met是一种酶，因此酶活性测定也是一种常见的met检测方法。
该方法基于met对特定底物的酶解活性，通过测量底物酶解产生的产物来评估met的活性水平。
常用的酶活性测定方法包括荧光酶活性测定、比色酶活性测定和放射性酶活性测定等。
分子生物学技术分子生物学技术在met的检测中也起到了重要的作用。
其中，常用的方法包括实时荧光定量PCR（qPCR）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和原位杂交等。
这些方法可以通过检测met的RNA水平来评估其表达水平，从而间接反映met的活性。
数据分析与解释除了选择合适的检测方法，对于met的检测结果的分析和解释也是非常重要的。
常用的数据分析方法包括统计学分析、差异分析和生物信息学分析等。
通过这些方法，可以比较不同样品之间的差异，并找出与疾病相关的差异表达基因。
小结met的检测方法多种多样，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择合适的检测方法时，需要考虑到实验的目的、样品的性质和实验条件等因素。
生物化学实验内容
生物化学实验内容生物化学是生物学和化学的交叉学科，研究生物体内化学物质的结构、组成和功能。
生物化学实验是在实验室中进行的一系列实验操作，旨在探索和研究生物分子的性质和功能。
本文将介绍一些常见的生物化学实验内容。
一、酶活性测定实验酶是生物体内的重要催化剂，参与体内的各种代谢过程。
酶活性测定实验通常使用底物和酶反应，通过测定产物的生成量或者底物消失量来评估酶活性。
例如，可以通过测定过氧化氢酶催化过氧化氢脱氢生成水和氧气的速率来评估过氧化氢酶的活性。
二、蛋白质定性与定量实验蛋白质是生物体内重要的生物大分子，参与体内的结构、功能和代谢过程。
蛋白质定性实验通常使用染色剂或者化学试剂与蛋白质反应，形成有色或者可见的沉淀或者出现其他特征。
例如，可以使用布鲁法试剂与蛋白质反应形成布鲁法蓝沉淀来定性蛋白质。
蛋白质定量实验常用的方法包括比色法、光谱法和比浊法等。
其中，比色法通常利用Bradford试剂与蛋白质反应生成紫色复合物，通过测定紫色复合物的吸光度来定量蛋白质的含量。
三、核酸提取与分析实验核酸是生物体内携带遗传信息的重要分子，参与遗传物质的复制和传递。
核酸提取和分析实验是研究基因组和遗传变异的重要手段。
核酸提取通常使用有机溶剂或者商用提取试剂盒进行，提取得到的核酸可以用于后续的PCR扩增、酶切、测序等实验。
四、酶电泳实验酶电泳是通过电场作用下的蛋白质的迁移速率差异来分离和鉴定酶的一种方法。
它常用于研究酶的同工酶谱、判定酶的活性、分析酶催化作用等。
常用的酶电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳等。
五、免疫检测实验免疫检测实验是通过体外检测抗原-抗体特异性相互作用来检测抗原或者抗体的存在和数量的一种方法。
常见的免疫检测实验包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、西方印迹、免疫荧光等。
这些实验方法广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
以上仅是生物化学实验中的一部分内容，实际的生物化学实验还包括分子生物学、细胞生物学、代谢物分析等多个领域。
重组蛋白表达和表征
重组蛋白表达和表征重组蛋白表达和表征随着现代生物技术的发展，重组蛋白技术已经成为了生物学和医学领域的重要研究工具。
通过表达目标蛋白，可以用于研究特定蛋白的结构、功能和作用机制等方面。
本文将着重介绍重组蛋白表达和表征的相关知识。
一、重组蛋白表达重组蛋白表达是指利用现代生物技术手段，将目标蛋白基因克隆入载体并表达出来的过程。
在这个过程中，需要选择一个适合的表达载体并将目标基因插入其中，然后通过合适的表达条件，使得目标蛋白在细胞中得到充分表达。
一般情况下，表达载体可以是大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等不同的表达宿主。
1. 选择表达载体选择适合的表达载体是重组蛋白表达的关键。
不同的表达宿主具有不同的优点和不足。
例如，大肠杆菌表达系统具有高效和简单的操作特点，但是在表达复杂蛋白时容易出现折叠和溶解问题；哺乳动物细胞表达可以在分泌型和细胞内型进行，但是由于表达时间周期长，表达量低等原因，通常用于大规模生产。
2. 克隆目标基因在选定适合的表达载体后，需要将目标基因克隆到载体中。
一般有PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法实现。
此外，还需要选择合适的启动子、选择子、标签等元素，以便完成高效稳定的表达。
3. 利用不同表达系统实现重组蛋白表达具体地，可以使用原核表达体系、酵母表达体系、哺乳细胞表达体系及昆虫表达体系等实现重组蛋白表达。
其中，原核表达体系中最常用的是大肠杆菌，酵母表达体系中最常用的是毕赤酵母，而哺乳细胞表达体系中最常用的则是CHO细胞等。
二、重组蛋白表征重组蛋白表征是指对已经表达出来的重组蛋白进行检测、纯化、鉴定等过程。
这个过程中需要采用多种手段，如SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot检测、质谱分析、生物活性检测等。
1. SDS-PAGE蛋白电泳SDS-PAGE蛋白电泳是常用的蛋白质分析方法，可以用来确定蛋白分子量、纯度等，以及检查蛋白的电泳性质等。
通过对目标蛋白的去氧核糖核酸和蛋白质的标记，可以检测到蛋白质的表达和纯化情况。
鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(1):5~10*基金项目：山东农业大学博士科研基金项目(No.23201)、“十一五”国家科技支撑计划重大项目(No.20061122)和山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(No.2006BS06015)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授，博士,主要从事畜禽传染病学和细胞因子的研究。
E-mail:<hkzhao@>.收稿日期：2006-01-11接受日期：2006-03-30·研究论文·鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测*李宏梅1,胡敬东1,马凤龙2,郑玉姝1,刘翠艳1,田兆菊1,赵宏坤1**(1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2.山东信得药业,青岛266061)摘要：对含有鸡白细胞介素-18()基因的质粒在大肠杆菌()内进行诱导表达，经亲和层析法对表达产物进行纯化，用微量细胞病变抑制法CEF-VSV 系统，检测其对SPF 鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果；用3H-TdR 掺入法和MTT 法分别检测其对T 淋巴细胞诱导转化和NK 细胞杀伤活性的作用。
结果表明，经诱导表达出分子量44kD 的目的蛋白(与GST 融合表达)，纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白；该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ，当浓度为250ng/mL 时诱导IFN-γ的活性最高，可达1×106U/mL ；但该蛋白不能直接抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长；能够刺激淋巴细胞显著增殖，浓度为250ng/mL 时效果最佳；适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK 细胞的杀伤活性，浓度为150ng/mL 时，作用最强。
利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白与天然鸡IL-18蛋白一样具有较广泛的生物学活性。
常见的分子生物学检验技术
常见的分子生物学检验技术常见的分子生物学检验技术包括PCR、Western blot、Northern blot、Southern blot、DNA测序等。
PCR（聚合酶链式反应）是一种能够在试管中扩增DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶酶活性的特性，通过不断重复的循环反应，在体外合成大量的目标DNA。
PCR技术广泛应用于基因重组、基因突变检测、DNA测序等领域。
Western blot是一种分析蛋白质表达的常用技术。
它可以通过将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并使用特异性抗体检测目标蛋白质的存在和数量。
Western blot技术在生物医学研究中常用于研究蛋白质的变化、鉴定蛋白质亚型等。
Northern blot是一种检测RNA表达的方法，类似于Western blot。
它可以在RNA样品中检测特定的RNA序列，并用于研究基因表达调控、寻找新的RNA转录本等。
Northern blot技术已被更先进的技术如RT-PCR取代，但在某些特定情况下仍然有其应用价值。
Southern blot是一种检测DNA序列的技术。
通过将DNA片段在电泳中分离，然后用特异性探针与目标DNA结合，可以检测特定的DNA序列。
Southern blot技术在基因组学研究中常用于检测基因突变、DNA重组等。
DNA测序是一种确定DNA序列的技术，也是分子生物学中最重要的技术之一。
通过测序反应和测序仪的分析，可以准确地确定DNA 的碱基序列。
DNA测序技术在基因组学、遗传学、进化生物学等领域中有广泛的应用，为科学家们提供了大量的基因信息。
除了以上几种常见的分子生物学检验技术，还有一些衍生的技术，如RT-PCR、荧光定量PCR、原位杂交等。
RT-PCR是一种能够通过逆转录将RNA转化为DNA，并在PCR反应中扩增的技术，常用于研究基因表达调控。
荧光定量PCR是一种在PCR反应中利用荧光信号定量检测DNA或RNA的技术，具有高灵敏度和高特异性。
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表达蛋白的生物学活性的检测
一、MTT比色法检测细胞活性
（一）原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。
对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
（二）试剂准备
1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。
2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。
3、MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。
5、L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。
6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。
二、DRG无血清培养检测促神经生长作用
操作步骤：
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。
2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG。
3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。
4、37℃5%CO2培养，每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。
三、注意事项
1、MTT有毒，注意防护。
2、单个DRG贴壁实验操作难度较大，需仔细耐心。