严重少精子症及无精子症的遗传学分析

ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ １７８ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｓ ａ ｃｏｎｔｒａｓｔ，ＡＺＦ ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｄｏｎｅ ｏｎ １００ｎｏｒｍａｌ ｓｅｍａｎ ｐａ－
ｒａｍｅｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ２３（１６．２０％）ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｋａｒｙｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ １４（９．８６％）ＡＺＦ ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ
中 国 实 验 诊 断 学 ２０１４ 年 ４ 月 第 １８ 卷 第 ４ 期 文 章 编 号 ：１００７－４２８７（２０１４）０４－０５６１－０４
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严重少精子症及无精子症的遗传学分析
杨 会 Leabharlann Baidu ，董 晶
（北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳５１８０３６）
摘要：目的 探讨严重 少 精 子 症、无 精 子 症 与 遗 传 学 的 关 系 。 方 法 采 用 外 周 血 细 胞 培 养 染 色 体 检 查 和 多 重
ｆｏｕｎｄ ｉｎ １４２ｓｅｖｅｒｅ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，３５（１９．６６％）ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｋａｒｙｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ２０（１１．２４％）ＡＺＦ
ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ １７８ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ＡＺＦ ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓ
基 金 项 目 ：深 圳 市 科 技 计 划 项 目 （２０１１０３０３２）
ＡＺＦ）区 域 缺 失 的 研 究。ＡＺＦ 分 为 ４ 个 区 域，即 ＡＺＦａ区、ＡＺＦｂ 区、ＡＺＦｃ 区、ＡＺＦｄ 区，ＡＺＦ 任 何 一个座位的缺失都可能导致生精功能障碍 。 ［３］ 本 研 究 对 １４２ 例 严 重 少 精 子 症 和 １７８ 例 无 精 子 症 患 者 进 行细胞遗传学 和 Ｙ 染 色 体 ＡＺＦ 微 缺 失 分 析，以 便 为 患 者 明 确 诊 断 ，对 患 者 进 行 正 确 的 生 育 指 导 。 １ 材 料 与 方 法 １．１ 材 料 １．１．１ 试剂和主要 仪 器 外 周 血 淋 巴 细 胞 培 养 基 购自德国 Ｃｙｔｏｇｅｎ 公司；全血 ＤＮＡ 提取及 ＡＺＦ 检 测试剂购自亚能生物技 术（深 圳）有 限 公 司；ＰＣＲ 仪 购自美国 ＡＢＩ公 司；凝 胶 成 像 分 析 系 统 购 自 美 国 ＢｉｏＲａｄ 公 司 。 １．１．２ 研 究 对 象 １４２ 例 严 重 少 精 子 症 和 １７８ 例 无精子症患者来自我院生殖中心及遗传咨询门诊。
ＰＣＲ 技术对１４２ 例 严 重 少 精 子 症 和 １７８ 例 无 精 子 症 患 者 进 行 细 胞 遗 传 学 和 Ｙ 染 色 体 ＡＺＦ 微 缺 失 检 测，同 时 对 １００
例精液参数正常男性进行 ＡＺＦ 微缺失检测作为对照。结果 在严重少精 子 症 患 者 中，染 色 体 异 常 率 为 １６．２０％（２３／
１４２），ＡＺＦ 缺失率为９．８６％（１４／１４２）；在无精子症患者中，染色体异常率为１９．６６％（３５／１７８），ＡＺＦ 缺失率 为 １１．２４％
（２０／１７８）；精液参数正常患者未检出 ＡＺＦ 微缺失。在严重少精子症和无精子症患者中，染色体 异 常 和 ＡＺＦ 缺 失 比 例
均显著高于精液参数正 常 对 照 组。 结 论 染 色 体 异 常 和 ＡＺＦ 微 缺 失 是 引 起 男 性 不 育 的 重 要 原 因 ，通 过 染 色 体 和
４６，ＸＹ（Ｙ＝１８） ４６，ＸＹ（小 Ｙ）
１４
无精子
均无缺失
６
无精子
均有缺失
２
无精子
均有缺失
１
无精子
有缺失
１
无精子
无缺失
７
３例无精子，４例严重少精子 １例有缺失，６例无缺失
１１
４例无精子，７例严重少精子 ５例有缺失，６例无缺失
４６，ＸＹ，ｔ（１；１２）（ｐ３２；ｑ２４） ４６，ＸＹ，ｔ（１；１）（ｑ２３；ｐ２２） ４６，ＸＹ，ｔ（４；８）（ｐ２６；ｑ１３） ４６，ＸＹ，ｔ（３；２１）（ｐ１０；ｑ１０） ４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１１；１４）（ｑ１０；ｑ１０） ４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１４；２１）（ｑ１０；ｑ１０）
１４２例严重少 精 子 症 患 者 检 出 ２３ 例 异 常 核 型 （１６．２０％），１７８例 无 精 子 症 患 者 检 出 ３５ 例 异 常 核 型（１９．６６％）。两组 患 者 染 色 体 异 常 核 型 比 率 均 高 于正常人群核型异常比率（０．３８％）［４］。所有异 常 核 型中，Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ综合 征 １４ 例，占 异 常 核 型 总 数 的 ２４．１４％ ；其 它 性 染 色 体 异 常 ２８ 例 ，占 异 常 核 型 总 数 的４８．２８％；常染 色 体 异 常 １６ 例，占 异 常 核 型 总 数 的 ２７．５９％ 。 在 所 有 ５８ 例 异 常 核 型 患 者 中 ，２４ 例 临 床表现为严 重 少 精 子 症，３４ 例 表 现 为 无 精 子 症；１５ 例检出 ＡＺＦ 缺失，４３例无缺失，见表１。
均无缺失 均无缺失 均无缺失
４７，ＸＹ，＋ｍａｒ
４６，ＸＹ，９ｑｈ＋ ４６，ＸＹ，ｉｎｖ（９）（ｐ１１ｑ１３）
４６，ＸＹ，２１ｐｓｔｋ＋
１
严重少精子
１
严重少精子
１
严重少精子
１
严重少精子
１
严重少精子
１
严重少精子
１
无精子
２
均为严重少精子
６
２ 例 无 精 子 ，４ 例 严 重 少 精 子
１
严重少精子
无缺失 无缺失 无缺失 无缺失 无缺失 无缺失 无缺失
ｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ
（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，２０１４，１８：０５６１）
据 世 界 卫 生 组 织 （ＷＨＯ）统 计，全 世 界 约 有 １０％－１５％的育龄夫妇患有不孕不育症，其中由男 性 因素导致的 不 育 症 约 占 ３０％－５０％，同 时 ３０％ 以 上 的男性不育症患者是由于遗传学异常导致生精功能 障 碍 引 起 ［１］，在 临 床 上 主 要 表 现 为 严 重 少 精 子 症 （精 子密度＜５×１０６／ｍｌ）和 无 精 子 症 （精 液 离 心 后 镜 检 未发现精子）。染色 体 异 常 是 造 成 男 性 不 育 的 重 要 遗传学因素，据统 计，在 男 性 不 育 患 者 中，染 色 体 异 常的发生 率 为 ２％－５％，在 少 精 子 症 和 无 精 子 症 中 更高达１５％［２］。Ｙ 染色体 为 男 性 特 有，与 男 性 特 异 的遗传学性状密切 相 关，Ｙ 染 色 体 与 男 性 不 育 的 关 系一直是男科学的研究重点，尤其 是 对 Ｙ 染 色 体 长 臂 （Ｙｑ１１）上 的 无 精 子 因 子 （ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ｆａｃｔｏｒｓ，
ＳＹ１４３；ＡＺＦｃ 区：ＳＹ２３９、ＳＹ２４２、ＳＹ２５４、ＳＹ２５５； ＡＺＦｄ 区：ＳＹ１４５、ＳＹ１５２，共 １５ 个 位 点，每 个 ＰＣＲ 反应体系里 均 有 Ｙ 染 色 体 性 别 决 定 基 因 （ＳＲＹ 基 因）做内控，并设 置 阳 性 对 照 （正 常 男 性 ＤＮＡ）和 阴 性对照（超纯水）。 扩 增 条 件：５０℃ １０ ｍｉｎ；９５℃ １０ ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ；５８℃ ６０ｓ；７２℃ ６０ｓ；共３５个循 环， ７２℃延伸１０ｍｉｎ。扩增产物进行２％琼脂糖凝胶 电 泳，电泳至溴酚蓝 迁 移 出 ２－３ｃｍ，在 紫 外 灯 下 观 察、 拍照记录结果。 ２ 结 果 ２．１ 外 周 血 染 色 体 检 查 结 果
表 １ 严 重 少 精 子 症 和 无 精 子 症 患 者 染 色 体 检 查 结 果
异常核型
例数
临床表现
ＡＺＦ 微缺失情况
４７，ＸＸＹ ４６，Ｘ，ｄｅｌ（Ｙ）（ｑ１１．２１） ４５，Ｘ，－Ｙ，－２２，＋ｄｅｒ（Ｙ）ｔ（Ｙ；２２）（ｑ１１；ｑ１０） ４５，Ｘ，ｄｅｒ（Ｙ）ｔ（Ｙ；２２）（ｑ１１．２１；ｑ１１．２） ４６，Ｘ，ｔ（Ｙ；１４）（ｐ１１；ｑ２４）
ＡＺＦ 微缺失检测可以为优生优育提供可靠的遗传信息依据。
关 键 词 ：男 性 不 育 症 ；严 重 少 精 子 症 ；无 精 子 症 ；染 色 体 异 常 ；无 精 子 因 子 微 缺 失
中 图 分 类 号 ：Ｒ３９４
文 献 标 识 码 ：Ａ
Ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ａｎｄ ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ＹＡＮＧ Ｈｕｉ－ｌｉｎ，ＤＯＮＧ Ｊｉｎｇ．（Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０３６，Ｃｈｉｎａ）
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Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ａｐｒｉｌ，２０１４，Ｖｏｌ １８，Ｎｏ．４
所有患者均按照 ＷＨＯ（２０１０）精液常规分析标准 规 定，连续３次精液分析，精 子 密 度 ＜５．０×１０６／ｍｌ的 患者诊断为严重少 精 子 症；精 液 离 心 沉 淀 镜 检 未 见 精子的患者诊断 为 无 精 子 症，并 选 取 １００ 例 精 液 参 数正常男性作为 ＡＺＦ 微缺失检测正常对照。 １．２ 方 法 １．２．１ 标本采集 无 菌 操 作 采 集 研 究 对 象 的 肝 素 抗凝静脉血２－３ｍｌ用于染色体检查，ＥＤＴＡ 抗凝静 脉血２－３ｍｌ用于 ＡＺＦ 微缺失检测。 １．２．２ 外周血细胞 培 养 染 色 体 分 析 无 菌 操 作 抽 取 ０．４ ｍｌ肝 素 抗 凝 全 血 置 于 淋 巴 细 胞 培 养 基 中 ，混 匀后置５％ＣＯ２ 培 养 箱 恒 温 ３７℃ 培 养 ７２ｈ，制 备 染 色体 标 本，Ｇ 显 带。 油 镜 下 分 析 ５ 个 分 裂 相，计 数 ３０个分裂相。 有 嵌 合 核 型 时 加 计 数 至 １００ 个 分 裂 相，必 要 时 加 做 Ｃ 显 带、Ｎ 显 带 进 一 步 分 析。 根 据 ＩＳＣＮ２００９ 人 类 细 胞 遗 传 学 国 际 命 名 体 制 命 名 。 １．２．３ Ｙ 染色体 ＡＺＦ 微缺失检测 使用深圳亚能 生物技术有限公司 Ｙ 染色体微缺失基因检测试剂 盒，采用多重 ＰＣＲ 方法对 ＤＮＡ 进行 ＡＺＦ 微缺失检 测，检 测 位 点 包 括 ＡＺＦａ 区：ＳＹ８２、ＳＹ８４、ＳＹ８６； ＡＺＦｂ 区：ＳＹ１２４、ＳＹ１２７、ＳＹ１２８、ＳＹ１３３、ＳＹ１３４、
ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｒｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｎｏｒｍａｌ ｓｅｍａｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍｏ－
ｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ａｎｄ ＡＺＦ ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｍａｌｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｋａｒｙｏ－
ｔｙｐｅ ａｎｄ ＡＺＦ ｍｉｃｒｏｄｅｌｅｔｉｏｎ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｎａｔａｌ ａｎｄ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｃａｒｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍａｌｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ；ｓｅｖｅｒｅ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ；ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ；ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ；ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ｆａｃｔｏｒ ｍｉ－
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ ａｎｄ ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｙｔｏｇｅ－
ｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ １４２ｓｅｖｅｒｅ ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ