《体上课用》PPT课件

载体应具备的条件
征
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
具有与特定受体细胞相适应的整合位点
具有较高的外源DNA的载装能 力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位 具点有合适的筛选标 记
质粒的基本特征
质粒
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复 制、被并稳定遗传的一类核酸分 质粒子常见于原核细菌和真 菌绝中大多数的质粒是DNA型 的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子 结构， 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
噬菌体或病毒DN 噬菌体或病毒是一类非细胞A微生物，能高效率高特异性
地宿侵主染细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组 中起潜来伏，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为 基程因的工有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩 增
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子（自主复制的单位)结构的不 同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质 粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群
以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此 不pS相C1容01、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此 不p1相5A容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此 不相容
pGEM-3Z：
多拷贝 装有多克隆位点（MC Apr S正）选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子
用于外源基因的高效
Baidu Nhomakorabea
lacZ’ PT7 MC
pGEM-3 E2743 b
S PSP6
p
ori
注意表：达T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的R N酶A所聚识合别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合 酶E.c，o如li ：BL21（DE3） 等
3 基因工程的基本条件
B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DN A考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载 体
载体的功能
载体的功能及特 征
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的 条件
载体的功能及特
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
396
452
拷贝数 2000 - 3000 / c装e有ll 多克隆位点（MC S正）选择颜色标记 lacZ’
lacZ'
pUC18 ori
2686 bp Apr
用于基因克隆和测 序
质粒
质粒的基本特征
质粒
质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒 可分为
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent pl a松s弛mi型d 复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent pl asmid
噬菌体或病毒DN
大肠杆菌的 l 噬菌体DN A
A l 噬菌体的生物学特性： 生物
结构 l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬 菌l 噬体菌体由外壳包装蛋白和l-DNA 组l-D成NA全长48502个核 苷l-D酸NA上至少有61个 基因
l 噬菌体生物学特性： 生物
结构
溶菌控制基
cos
晚期控因制基
DNA合成因控制基
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受 自拷己贝的数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数 恒因定此，在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处 于细同胞一内 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到 同拷一贝种数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数 不其同中，拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优 势
质粒的基本特征
质粒
携带特殊的遗传标 记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因使，得这寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，选择标 记基因，如最常用的抗药性基因：抗氨苄青霉素、抗四 环素、抗氯霉素、抗卡那霉素等
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒
质粒的构建
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶 切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的 要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构 建目。前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型 质粒构建的：
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
Pla MC
pUC18/1
cS
5-溴-4-氯-3-吲9 哚基-b-D-半乳
糖苷
X-ga
l
CH2OH
HO
O
OHH H
O
H
H
H OH
b
Cl Br
N
lacZ’
a b-半乳糖苷酶的a-肽
段
Cl O
Br
N
N
Br
Cl
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
质粒
质粒的基本特征
质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转 移另到一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合 作如用Col、R的其它成员
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合 型的质存粒在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 mob 基因决定
l 用于基因克隆，
6KB片段而不
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
影响其功能
Origin of Replication Hind II
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基 因ColTEc1r 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记 基RS因F2E1124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基 因 Apr
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pBR322：
松弛型复制
Pvu I
Pst I
拷贝数 50 - 100 / cel