(完整版)荧光漂白恢复技术PPT
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完整版荧光漂白恢复技术
荧光漂白恢复技术
（fluorescence recovery after photobleaching ，FRAP）
09生物 季刚 裴家平
FRAP关键技术简介
?FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 ?FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁
移特性的技术。 ?当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530 –600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1 –2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were
（fluorescence recovery after photobleaching ，FRAP）
09生物 季刚 裴家平
FRAP关键技术简介
?FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 ?FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁
移特性的技术。 ?当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530 –600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1 –2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were
荧光增白剂PPT课件
7
优点，按优化反应条件：邻氨基对甲基苯酚与苹果 酸物质的量比为2:1～2:1.05；除初始升温阶段外， 反应温度分三段控制：第一阶段140℃左右，第二阶 段170℃以下，第三阶段190℃以上，所合成的产品 白度高而收率达85％以上。
8
实际工艺操作
将1050Kg氯苯投入缩合反应釜中，加入105Kg 对甲邻氨基苯酚、70Kg苹果酸，通入CO2气体，驱 尽釜内空气，搅拌，升温回流反应，当冷凝器的分 水器出水量达15Kg时，向反应釜中加入4～5Kg硼酸， 继续加热回流反应，直至再分出水量达23Kg（共分
很好，但升华牢度不够好。 5
1.3 荧光增白剂DT合成工艺
荧光增白剂DT制备路线有十余种。国内基本上采用 由邻氨基对甲苯酚与DL-苹果酸（羟基丁二酸）脱水 缩合以“一锅煮”法反应而得到。即采用兰登贝格 苯并噁唑合成法。近年来国内的合成研究也主要集 中于此法改进。反应式如下：
O H
+ N H 2
C at H O O CC HC H 2 C O O H
荧光增白剂DT
1.1 发展 1.2 性质 1.3 合成工艺 1.4 应用 1.5 结论
1
1.1 荧光增白剂DT 发展
织物经漂白后，为了进一步获得满意的白 度；或某些浅色织物要增加鲜艳度，通常采 用能发荧光的有机化合物进行加工，这种化 合物称为荧光增白剂。目前，荧光增白剂在 纺织、造纸、塑料、及合成洗涤剂等工业都
2
有着广泛的应用。全世界生产的荧光增 白剂现已有15种以上的结构，其商品已 经超过1000多种，年总产量达10万吨以 上，占染料总产量的12%左右，而且其产 量年增长率大于染料或颜料的年增长率。
3
DT是瑞士汽巴公司五十年代末的产品, 商品名为Uvitex ERN,主要用于涤纶增白,也 可用于塑料、涂料的增白。我国生产的荧光 增白剂DT的产量约占增白剂总产量的1/4左 右，是仅次于荧光增白剂VBL的重要品种。
优点，按优化反应条件：邻氨基对甲基苯酚与苹果 酸物质的量比为2:1～2:1.05；除初始升温阶段外， 反应温度分三段控制：第一阶段140℃左右，第二阶 段170℃以下，第三阶段190℃以上，所合成的产品 白度高而收率达85％以上。
8
实际工艺操作
将1050Kg氯苯投入缩合反应釜中，加入105Kg 对甲邻氨基苯酚、70Kg苹果酸，通入CO2气体，驱 尽釜内空气，搅拌，升温回流反应，当冷凝器的分 水器出水量达15Kg时，向反应釜中加入4～5Kg硼酸， 继续加热回流反应，直至再分出水量达23Kg（共分
很好，但升华牢度不够好。 5
1.3 荧光增白剂DT合成工艺
荧光增白剂DT制备路线有十余种。国内基本上采用 由邻氨基对甲苯酚与DL-苹果酸（羟基丁二酸）脱水 缩合以“一锅煮”法反应而得到。即采用兰登贝格 苯并噁唑合成法。近年来国内的合成研究也主要集 中于此法改进。反应式如下：
O H
+ N H 2
C at H O O CC HC H 2 C O O H
荧光增白剂DT
1.1 发展 1.2 性质 1.3 合成工艺 1.4 应用 1.5 结论
1
1.1 荧光增白剂DT 发展
织物经漂白后，为了进一步获得满意的白 度；或某些浅色织物要增加鲜艳度，通常采 用能发荧光的有机化合物进行加工，这种化 合物称为荧光增白剂。目前，荧光增白剂在 纺织、造纸、塑料、及合成洗涤剂等工业都
2
有着广泛的应用。全世界生产的荧光增 白剂现已有15种以上的结构，其商品已 经超过1000多种，年总产量达10万吨以 上，占染料总产量的12%左右，而且其产 量年增长率大于染料或颜料的年增长率。
3
DT是瑞士汽巴公司五十年代末的产品, 商品名为Uvitex ERN,主要用于涤纶增白,也 可用于塑料、涂料的增白。我国生产的荧光 增白剂DT的产量约占增白剂总产量的1/4左 右，是仅次于荧光增白剂VBL的重要品种。
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP共41页文档
Cartoon of FRAP
Bleach creates “hole” of fluorophores, Diffusion is measured by “hole filling in”
Bleach high power Monitor low power
Analysis of membrane
A way of understanding diffusion: Random Walk
Spread of molecules from one spot is proportional to square root of time for random walk. Therefore, to go 2X as far takes 4X as long.
e.g. Luby-Phelps et al., 1994. SekSek et al. 2019.
D = kT/f
D =w2/4D
Not reliable, cytoplasm complicated collection of fluid, cytoskeletal components, endosome, etc: simple viscosity not sufficient
Different bleaching geometries yield different types of information
Pre-bleach Photobleach image
Post-bleach image
No recovery Recovery
FRAP of GFP in Mitochondria
• Simplifies fits of recovery curves to:
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP
Fast limit: cytoplasm Slow limit: membrane bound
Suggests barriers (cristae) need to be large
Occlude 90% space
Verkman, TIBS, 2019
Size dependence of dextrans (polysaccharides) diffusion in solution
2000 Nature Cell Biology)
Experimental Setup
• Laser beam focused or through small field diaphragm
• Rapid shutter to switch from high powered beam for bleach to attenuated beam for recovery same power won’t work-Keep bleaching)
• Now can be done with laser scanning confocal instruments. (for some cases-e.g. membranes)
Idealized photobleaching data
Y = mobile fraction X
D =w2/4D
Diffusion of membrane components can be seen as a two dimensional diffusion problem
• Membrane is modeled as infinite plane
• Viscosity of the lipid bilayer is ~ 2 orders of magnitude higher than water
染整工艺原理上课件第三章 漂白
2、在双氧水漂白液中为何要加入稳定剂？
3、水玻璃做为氧漂稳定剂的主要缺点是什么？
4、试设计合理的双氧水连续汽蒸漂白工艺（包 括工艺处方、工艺流程、工艺条件）
铜离子和水玻璃对H2O2 漂白影响（催化、稳定）
水玻璃 g/L
7.0
Cu2SO4 g/L 2h后分解率,% 58
100(45min)
织物白度，% 95.5
（二）常用漂白剂
1.还原剂漂白 保险粉（Na2S2O4)、硫酸氢钠（ NaHSO3 ）、 SO2 • 漂白效果不稳定，日照泛黄 • 羊毛 2．氧化剂漂白 • 氯漂（ NaOCl）、亚漂（NaClO2 ）、氧漂（ H2O2） • 白度高，白度稳定性好 • 会损伤纤维 • 适用各种纤维
氯 氯(Cl2)、次氯酸钠（NaClO） 系 亚氯酸钠（NaClO2)
名词
有效氯：指次氯酸钠溶液加酸后释放出氯气 的数量。P110
碱煮强力：1g/L烧碱溶液中沸煮1h后的强力
三种常用漂白剂的使用性能比较
NaOCl
H2O2
NaClO2
适用对象 C.及混纺中 C.及混纺中高 较高档棉
低档品 档, 蛋白质织物 及其混纺物
白度
一般
较好
很好
白度稳定性 脱氯不净 不易泛黄
脱氯不净
稳定剂类型及作用原理
按作用机理分： • 吸附型 • 络合型 按化学组成分： • 硅类稳定剂 • 非硅类稳定剂
吸附型稳定剂
• 硅酸钠（Na2SiO3) 硅酸钠在硬水中（适量钙、镁盐存在）形成硅
酸盐胶体MgSiO3(CaSiO3)，能吸附重金属离子。 采用软水则加入0.1～02g/L硫酸镁.
优点：稳定效果好，价格便宜，白度好 缺点：易结硅垢，手感发硬，染疵，沉淀在设备导布
3、水玻璃做为氧漂稳定剂的主要缺点是什么？
4、试设计合理的双氧水连续汽蒸漂白工艺（包 括工艺处方、工艺流程、工艺条件）
铜离子和水玻璃对H2O2 漂白影响（催化、稳定）
水玻璃 g/L
7.0
Cu2SO4 g/L 2h后分解率,% 58
100(45min)
织物白度，% 95.5
（二）常用漂白剂
1.还原剂漂白 保险粉（Na2S2O4)、硫酸氢钠（ NaHSO3 ）、 SO2 • 漂白效果不稳定，日照泛黄 • 羊毛 2．氧化剂漂白 • 氯漂（ NaOCl）、亚漂（NaClO2 ）、氧漂（ H2O2） • 白度高，白度稳定性好 • 会损伤纤维 • 适用各种纤维
氯 氯(Cl2)、次氯酸钠（NaClO） 系 亚氯酸钠（NaClO2)
名词
有效氯：指次氯酸钠溶液加酸后释放出氯气 的数量。P110
碱煮强力：1g/L烧碱溶液中沸煮1h后的强力
三种常用漂白剂的使用性能比较
NaOCl
H2O2
NaClO2
适用对象 C.及混纺中 C.及混纺中高 较高档棉
低档品 档, 蛋白质织物 及其混纺物
白度
一般
较好
很好
白度稳定性 脱氯不净 不易泛黄
脱氯不净
稳定剂类型及作用原理
按作用机理分： • 吸附型 • 络合型 按化学组成分： • 硅类稳定剂 • 非硅类稳定剂
吸附型稳定剂
• 硅酸钠（Na2SiO3) 硅酸钠在硬水中（适量钙、镁盐存在）形成硅
酸盐胶体MgSiO3(CaSiO3)，能吸附重金属离子。 采用软水则加入0.1～02g/L硫酸镁.
优点：稳定效果好，价格便宜，白度好 缺点：易结硅垢，手感发硬，染疵，沉淀在设备导布
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP-40页精品文档
Cartoon of FRAP
Bleach creates “hole” of fluorophores, Diffusion is measured by “hole filling in”
Bleach high power Monitor low power
Analysis of membrane
NNNooA way of understanding diffusion: Fick’s Law J D x
age • Jisflux • D is diffusion constant • is concentration
Diffusion Constant: What controls it?
J D
x
Verkman, J. Cell Biology 1999
Heavy dextrans very slow Mobile fraction low: binding More polarizable
FRAP in Cytoplasm
J D
x
• Problem is much more complicated because of three dimensional freely diffusing geometry.
• As shown by Saffman and Delbruck, the translational diffusion coefficient for membrane components depends only on the size of the membrane spanning domain
Axelrod et al., 1976
PSF and Beam Waist
荧光漂白恢复技术PPT
（PLoS ONE |August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e22962）
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at 37℃ in the presence of 5% CO2.
（1）注意实验温度的控制。 （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而 定。 （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂 白后的荧光淬灭。
Page 7
FRAP技术的不足之处
第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能 观察单个蛋白的移动。 其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部 条件的限制。
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at 37℃ in the presence of 5% CO2.
（1）注意实验温度的控制。 （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而 定。 （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂 白后的荧光淬灭。
Page 7
FRAP技术的不足之处
第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能 观察单个蛋白的移动。 其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部 条件的限制。
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.
教学课件：第十三章-荧光增白剂
在个人护理用品中，荧光增白剂主要用于沐浴露、洗发水、润肤乳等产品的配方中， 增加产品的视觉效果和使用感受。
在化妆品中，荧光增白剂主要用于粉底、口红、眼影等产品的制造中，使产品更加 亮丽和具有吸引力。
其他领域
荧光增白剂还广泛应用于纸张、 涂料、油漆、油墨等领域中，以 提高产品的白度和亮度，改善视
觉效果和品质。
耐热性
稳定性
荧光增白剂在高温下保持其性能的能力， 通常以热稳定性表示。
荧光增白剂在不同环境条件下保持其性能 的能力，包括化学稳定性、pH稳定性等。
03
荧光增白剂的应用领域
纺织品领域
荧光增白剂在纺织品领域中主要用于棉、 麻、丝、毛等天然纤维以及涤纶、腈纶 等合成纤维的染色和加工过程中，提高 产品的白度和光泽度，增强视觉效果。
THANKS
感谢观看
纺织工业
用于棉、麻、丝、毛等纤维的 增白和调色，提高纺织品的白 度和鲜艳度。
日化产品
用于洗涤剂、洗衣粉、肥皂等 日化产品的增白和调色，提高
产品的白度和亮度。
荧光增白剂的发展历程
20世纪初
荧光增白剂的发现和研究阶段，最早 的荧光增白剂是苯酚磺酰酞。
20世纪50年代
荧光增白剂开始进入工业化生产和应 用阶段，主要用于纸张和纺织品的增 白。
教学课件：第十三章-荧 光增白剂
• 荧光增白剂简介 • 荧光增白剂的种类与性能 • 荧光增白剂的应用领域 • 荧光增白剂的生产工艺与技术 • 荧光增白剂的安全与环保问题 • 教学总结与展望
01
荧光增白剂简介
定义与特性
定义
荧光增白剂是一种能够吸收紫外光并 发出蓝紫色荧光的染料，主要用于提 高塑料、纸张、纤维等材料的白度和 亮度。
在化妆品中，荧光增白剂主要用于粉底、口红、眼影等产品的制造中，使产品更加 亮丽和具有吸引力。
其他领域
荧光增白剂还广泛应用于纸张、 涂料、油漆、油墨等领域中，以 提高产品的白度和亮度，改善视
觉效果和品质。
耐热性
稳定性
荧光增白剂在高温下保持其性能的能力， 通常以热稳定性表示。
荧光增白剂在不同环境条件下保持其性能 的能力，包括化学稳定性、pH稳定性等。
03
荧光增白剂的应用领域
纺织品领域
荧光增白剂在纺织品领域中主要用于棉、 麻、丝、毛等天然纤维以及涤纶、腈纶 等合成纤维的染色和加工过程中，提高 产品的白度和光泽度，增强视觉效果。
THANKS
感谢观看
纺织工业
用于棉、麻、丝、毛等纤维的 增白和调色，提高纺织品的白 度和鲜艳度。
日化产品
用于洗涤剂、洗衣粉、肥皂等 日化产品的增白和调色，提高
产品的白度和亮度。
荧光增白剂的发展历程
20世纪初
荧光增白剂的发现和研究阶段，最早 的荧光增白剂是苯酚磺酰酞。
20世纪50年代
荧光增白剂开始进入工业化生产和应 用阶段，主要用于纸张和纺织品的增 白。
教学课件：第十三章-荧 光增白剂
• 荧光增白剂简介 • 荧光增白剂的种类与性能 • 荧光增白剂的应用领域 • 荧光增白剂的生产工艺与技术 • 荧光增白剂的安全与环保问题 • 教学总结与展望
01
荧光增白剂简介
定义与特性
定义
荧光增白剂是一种能够吸收紫外光并 发出蓝紫色荧光的染料，主要用于提 高塑料、纸张、纤维等材料的白度和 亮度。
看荧光增白剂如何逆转织物暗淡无光
看荧光增白剂如何逆转织物暗淡无光
对于白色的纺织品，通常会有一点点蓝光被吸收，使得产品看起来变成了黄色，同时白度下降显出暗旧感。
在发明荧光增白剂前，抵消黄色的其中一种方法是使用蓝色染料。
然而添加蓝色会减少可见光光谱中的长波长部分的反射。
其结果是，纺织品能够呈现出中和的白色，但同时也损失了一部分亮度，使材料看起来变得灰暗。
另一种方法是使用化学漂白，通过氧化纺织品表面的色素使其褪色，但同时对材料本身有着相当的破坏作用。
幸运的是，在20世纪初，荧光增白剂被发现后，以上两种方法的缺陷都被克服了。
荧光增白剂本省是无色，即使相对于淡色的有机色素来说。
它的原理是能吸收紫外线光并重新发出蓝色光。
与添加蓝色染料相比，荧光增白剂主要减少紫外线和近似可见光的反射；而在可见光部分，光强度由于荧光反射还大大增强了，因此荧光增白剂可用来增强光源。
在阳光下，荧光增白剂可以抵消纺织品上不需要的黄色。
更美妙的是，由于人眼不可
见的紫外线被转换成了可见光，材料的亮度而被提高成为一种绚丽的白色。
杭州绿典化工有限公司感到非常激动的是，荧光增白剂成功逆转暗淡无光的纤维织物，给到他们亮白的视觉效果，得到全新的体验！。
齐全版(荧光PCR技术)ppt课件
实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
FRAP
Date
1.1
FRAP
Proteins moving within the cell nucleus
Investigation of 3 different proteins involved in essential nuclear functions TCS SP at the University of Maryland, USA Measurement of kinetic Properties of proteins using photobleaching techniques Bleaching: A defined area of a living cell is bleached by a single, high-powered spot laser pulse of 250ms (beampark). Recovery of fluorescence in the bleached area is recorded by Sequential imaging scans. It is shown that proteins move rapidly thoughout the nucleus
FRAP
Date
1.1
Flymode FRAP for highest synchronized time resolution Live Date Mode enable interactive physiological analysis
FRAP
Date
1.1
Basic Principle of FRAP
FRAP
Date
1.1
荧光光漂白后的恢复：FRAP
细胞间隙连接（Gap Junction，GJ)是目前被认为能进行细胞间物质和信息 直接交流的 细胞间连接形式，它参与的 这种物质与信息交流被称为由 间隙连接介导的细胞间通讯（gap junction intercellular communication,GJIC). GJIC的生物学作用： GJIC可协调不同细胞、组织间的代谢或电传导，使各种信息有效地到达相应 的细胞、组织。 GJIC与胚胎发育、细胞分化过程有密切关系。 GJIC对于细胞的生长控制十分重要。 GJIC与细胞凋亡过程有密切的关系。
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP
Problems with FRAP of cytoplasmic components (2 orders of magnitude faster
than membranes)
1. Diffusion is fast compared to bleaching and monitoring rate D=ms : cannot truly scan
Spot Photobleaching
•Bleach and monitor single diffraction limited spot •Assumes infinite reservoir of fluorescent molecules (hole can fill back in) •Use D = w2/4D to obtain D •Determine w = nominal width of Gaussian spot by other optical method 1/e2 point •Fit fluorescence recovery curve to obtain D
Real FRAP data
More Diffusion types
Fx,t/F()12texpxt2/w2t Fullyrecovers
with
w2tw021t/D at/1t/
Important for Large macromolecules: Collisions, obstacles, binding
2 If use small bleach regions, redistribution may occur during bleaching. In fact, often cannot observe bleach of small region at all.
荧光漂白恢复技术PPT
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FRAP技术的基本要求
选择合适的荧光探针
具备精确可控的激光激发和荧光检测设备
激光扫描共聚焦显微镜
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FRAP 的三个阶段
漂白前
漂白
漂白后恢复
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
使用强激光在短时 间内扫描漂白区域
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
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注：
漂白前和漂白后恢复都用尽可能弱的激光扫描全细胞，目的是 得到扫描图像而不引起荧光淬灭，
FRAP关键技术简介
FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁 移特性的技术。
当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内 分子的定性知识，基本了解了各细胞器的分子组成，找到许多在细胞生命 周期中发挥重要作用的蛋白质，确认了许多重要蛋白质之间相互作用的存 在并初步描绘出一些信号通路。 但细胞的各种生物学功能和现象都是借助相关分子实现的，当前的研究重 点和难点就集中于解答分子实现各种功能的机制。
漂白阶段则使用强激光在短时间内扫描漂白区域，目的是使区 域内的荧光全部淬灭。
在整个过程中，监测漂白区域在各时间段的荧光强度变化并绘 制曲线，从恢复曲线及其数据就可以得到关于分子迁移速率、 动态分子比例等信息。
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FRAP实验注意事项
做FRAP实验还应当注意以下几点，否则就易得到错误结果。
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FRAP analysis We performed FRAP experiments on EYFP-expressing NLFK and HeLa cells. When the measured recovery data were analyzed by the Soumpasis method, we found a cytoplasm diffusion coefficient of D~0:75+0:3 mm2/s (n =8) for the NLFK cells and D~1:83+0:28 mm2/s (n =13) for the HeLa cells. The difference in the liquid phase properties (‘viscosity’) of these cells is statistically significant (pv0:05), which indicates that they have different macromolecular concentrations. The average cytoplasm diffusion coefficients, SDcpT, were 15:5+2:7 mm2/s for the NLFK and 20:6+5:0 mm2/s for the HeLa cells, being thus quite similar. In both cell lines the cytoplasm diffusion coefficient,Dcp(r), varied significantly (Fig. 7 c).
珍珠的漂白处理 3-完整版PPT课件
(5)过氧化氢分解后，不仅漂白液的浓度 会变,还会改变溶液的pH值，所以除了要 经常补充过氧化氢溶液外，还要注意调 节pH值,使pH值保持在7.5左右。 (6)把已达到漂白要求的珍珠取出来，未 达到漂白要求的珍珠继续进行漂白。注 意要将因漂白时间长而表面已被腐蚀的 珍珠也取出来。
珍珠的漂白处理
(7)把漂白好后取出来的珍珠用水反复冲 洗，直到OP洗净为止。只要还残留有OP, 冲洗的水中就会出现泡沫,故洗第二天，把浸泡的珍珠倒出，过滤掉 水，让它们自然干燥。 ➢ 漂白珍珠的增白处理
谢谢观看！
珍珠的漂白处理
(3)控制漂白箱的温度在35~40°C之间， 漂白时间一般3~7d。 (4)每隔2~3h摇动漂白瓶1min左右，摇动 的目的有两个:一.是使珍珠能够均匀地接 受日光灯的照射;二是赶跑因过氧化氢 (H2O2)分解而滞留在珍珠孔中的气泡， 同时可加快珍珠的内外和瓶中漂白液的 交换。
珍珠的漂白处理
人工宝石及宝石优化处理
珍珠的漂白处理
珍珠的漂白处理
➢ 漂白操作 (1)把打好孔的珍珠放在纱布口袋中，然后 放入水中煮沸2~ 8h,以去除珍珠孔中的浮 粉和其他可溶性杂质。 (2)把沥干水的珍珠放人漂白瓶的漂白液中, 摇动漂白瓶lmin,去除珍珠孔中可能出现的 气泡(珍珠孔比较小，容易出现小气泡，阻 止水溶液进人),待漂白的珍珠不应超过1kg, 漂白液液面应高出珍珠表面lcm以上。
珍珠的漂白处理
(7)把漂白好后取出来的珍珠用水反复冲 洗，直到OP洗净为止。只要还残留有OP, 冲洗的水中就会出现泡沫,故洗第二天，把浸泡的珍珠倒出，过滤掉 水，让它们自然干燥。 ➢ 漂白珍珠的增白处理
谢谢观看！
珍珠的漂白处理
(3)控制漂白箱的温度在35~40°C之间， 漂白时间一般3~7d。 (4)每隔2~3h摇动漂白瓶1min左右，摇动 的目的有两个:一.是使珍珠能够均匀地接 受日光灯的照射;二是赶跑因过氧化氢 (H2O2)分解而滞留在珍珠孔中的气泡， 同时可加快珍珠的内外和瓶中漂白液的 交换。
珍珠的漂白处理
人工宝石及宝石优化处理
珍珠的漂白处理
珍珠的漂白处理
➢ 漂白操作 (1)把打好孔的珍珠放在纱布口袋中，然后 放入水中煮沸2~ 8h,以去除珍珠孔中的浮 粉和其他可溶性杂质。 (2)把沥干水的珍珠放人漂白瓶的漂白液中, 摇动漂白瓶lmin,去除珍珠孔中可能出现的 气泡(珍珠孔比较小，容易出现小气泡，阻 止水溶液进人),待漂白的珍珠不应超过1kg, 漂白液液面应高出珍珠表面lcm以上。
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荧光漂白恢复测定巨噬细胞Fc受体的荧光恢复率和运动分数
（山东大学硕士学位论文《荧光漂白恢复测定巨噬细胞Fc受体的流动性》，李建业，005.5）
▪ 采用Alexa 488标记的羊抗鼠IgG间接标记巨噬细胞Fc受体，用激光共聚 焦系统的强脉冲激光漂白，弱强度激光扫描，光电倍增管(PMT)检测， Fluoview软件记录数据并分析处理。
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漂白区域的荧光强度随时间的 变化示于图2.11。
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漂白以后恢复过程荧光强度的变化 示于图2.13。
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漂白区域在漂白前后的荧光强度 随时间的变化示于图2.14。
说明：细胞膜具有流动性， 膜表面上Fc受体能够迁移。
Protein Diffusion in Mammalian Cell Cytoplasm
定。 ▪ （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂
白后的荧光淬灭。
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FRAP技术的不足之处
▪第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能 观察单个蛋白的移动。
▪其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部 条件的限制。
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FRAP 的应用
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分子的定性知识，基本了解了各细胞器的分子组成，找到许多在细胞生命 周期中发挥重要作用的蛋白质，确认了许多重要蛋白质之间相互作用的存 在并初步描绘出一些信号通路。 ▪ 但细胞的各种生物学功能和现象都是借助相关分子实现的，当前的研究重 点和难点就集中于解答分子实现各种功能的机制。 ▪ 这就需要掌握活细胞生理状态下分子运动的各种信息，近年来发展的一些 技术手段为获得有关重要信息提供了有力的工具，FRAP技术就是其中一 种重要方法。
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FRAP技术的基本要求
▪ 选择合适的荧光探针 ▪ 具备精确可控的激光激发和荧光检测设备
激光扫描共聚焦显微镜
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FRAP 的三个阶段
漂白前
漂白
漂白后恢复
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
使用强激光在短时 间内扫描漂白区域
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
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注：
➢漂白前和漂白后恢复都用尽可能弱的激光扫描全细胞，目的是 得到扫描图像而不引起荧光淬灭，
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FRAP原理
▪ In FRAP, a region of the cell is exposed to high-intensity laser light, causing the fluorophores within that region to irreversibly lose their ability to fluoresce. Recovery of fluorescence in that region yields information about molecular diffusion and binding in the cell.
➢漂白阶段则使用强激光在短时间内扫描漂白区域，目的是使区 域内的荧光全部淬灭。
➢在整个过程中，监测漂白区域在各时间段的荧光强度变化并绘 制曲线，从恢复曲线及其数据就可以得到关于分子迁移速率、 动态分子比例等信息。
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FRAP实验注意事项
▪ 做FRAP实验还应当注意以下几点，否则就易得到错误结果。 ▪ （1）注意实验温度的控制。 ▪ （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而
（PLoS ONE |August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e22962）
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at
荧光漂白恢复技术
（fluorescence recovery after photobleaching ，FRAP）
09生物 季刚 裴家平
FRAP关键技术简介
▪ FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 ▪ FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁
移特性的技术。 ▪ 当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内
37℃ in the presence of 5% CO2.
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.