454基因组测序技术
Illumina、454、ABI测序仪比较
Illumina 、454 、ABI 测序仪比较Illumina 测序仪Illumina 公司的新一代测序仪Genome Analyzer 最早由Solexa 公司研发，利用其专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator ）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Illumina 公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa ，就是为了促成Genome Analyzer 的商品化。
Genome Analyzer 作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
Genome Analyzer 自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。
今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，《《Nature 》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。
它们全是依赖Genome Analyzer 完成的。
哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。
根据去年底的数据，Genome Analyzer 已售出约200台，估计是市场占有率最广的。
前不久，华大基因再添置了12台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有29台Genome Analyzer 。
而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad 研究院拥有47台Illumina 测序仪。
众多实验室之所以选择Illumina ，看中的无疑是Genome Analyzer 的高性价比。
上个月，Illumina 将Genome Analyzer II 升级到Genome Analyzer IIx ，距年底实现单次运行获得95 GB 数据的宏伟目标又近了一步。
第二代测序技术
SO、油包水PCR
SOLiD流程
3、含DNA模板P1磁珠的固定
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程SOLD流程5. 数据分析原理
Polonator
第二代高通量测序技术简介
四大高通量测序平台
Solexa，454 (GS-FLX)，
SOLiD和Polonator
测序原理
合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(Sequencing by Ligation)
454 (GS-FLX)
Roche：（2005，2007，2008） 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
Polonator流程
测序原理： Polonator系统高质量测序是一种以连接 反应进行DNA序列分析的技术，该系统采用 结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板， 以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧 光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续 的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行 大规模高通量测序。
454 (GS-FLX)流程
3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入 PTP板中供测序反应使用。
454 (GS-FLX)流程
4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行 当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿 个碱基信息
Solexa-Illumina Genome Analyzer
至300-800bp间，经末端修复与特异性接头 连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。
新一代测序法简介
新一代测序法简介新一代测序方法是一种直接测序法，它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析)，也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量（定量分析），以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在（交叉对比分析）。
自2004年，454测序技术发展以来，已经出现的测序产品超过六种之多。
这些产品的技术特点见下表：产家名称产品技术特点优缺点化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度Roche(454 Life Science) 焦磷酸标记的链反应焦磷酸基标记<1% 较复杂，需PCR 中等Illumina（Solexa）四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂，需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单，无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标记焦磷酸基标记3%—8% 简单，无需PCR 高VisiGen 焦磷酸基标记FRET 焦磷酸基标记3%—8% 简单，无需PCR 高在这些技术中，从所分析的样本在测序前是否需要扩增，大致可以分为两类，即克隆扩增型和单分子测序型。
两种类型在测序技术上区别并不大，但对结果的影响却有不小的差别。
主要体现在两个方面：（1）单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况，尤其是在需要定量分析的情况下。
而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等，这会对基因表达的定量分析造成影响；（2）单分子测序具有通量更高的优势。
克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升，在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时，也降低了不同类型分子出现的机会。
面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing（单分子实时DNA测序）。
454测序技术基本原理
454测序技术基本原理454测序技术是一种基于DNA串联式测序的高通量测序技术。
该技术利用PCR扩增的方式将DNA分子固定在微球上，然后将这些微球均匀地分散在pico流水仪上，通过单个核苷酸连续测序的方式得到DNA序列信息。
本文将从实验步骤、原理和优缺点三个方面阐述454测序技术的基本原理。
实验步骤1、DNA提取测序前需要从样品中提取目标DNA物质。
对于不同的样品，提取方法不同，通常采用化学试剂、机械破碎或针刺取等方法提取DNA。
2、PCR扩增PCR扩增是将DNA序列按照一定的温度循环条件进行复制的过程。
PCR扩增由若干次循环组成，通常可分为三步：a) 熔解（Denaturation）：高温（95℃~98℃）使DNA双链分离成两个单链，形成单链DNA模板。
b) 合成（Annealing）：温度回降（50℃~70℃），引物结合到单链DNA上，形成DNA 双链结构。
c) 延伸（Extension）：DNA聚合酶将双链DNA沿模板链向3'端延伸合成新的DNA链。
PCR扩增反应得到的DNA产物可分为两种类型：大量扩增的目标DNA和微球放置板上随机捕获的非模板DNA。
3、微球固定4、测序反应测序反应通过单个核苷酸的连续探测，对目标DNA序列进行识别和测序。
精细的光学和声学系统检测每次核苷酸加入后发出的光信号，然后排除错误数据并将相邻的场景、质量和信号强度合并以产生最终测序可靠的序列。
原理1、基于串联式测序在测序反应中，每个核苷酸单元依次加入为该反应产物的单一串联链的一部分。
这种串联式测序方式将初步测序的精度扩展到所有测序反应产物的终端序列。
2、基于荧光原理测序反应中每个核苷酸单元的加入和检测均通过荧光技术实现。
特殊荧光分子被加入到产物反应液中，随着核苷酸单元的加入和反应的进行，每个反应产生的荧光信号与特定的核苷酸单元有关。
3、基于高通量454测序技术结合了反应批处理和DNA克隆，大大增加了读取的序列数量。
基因组测序方法和流程
基因组测序方法和流程基因组测序是一种重要的分子生物学技术，用来确定生物个体的全基因组序列。
下面将介绍几种常见的基因组测序方法和其流程。
Sanger测序方法Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它通过DNA链终止反应来测定DNA序列。
Sanger测序的流程如下：1. DNA片段的扩增：通过聚合酶链反应(PCR)或其他扩增方法，将待测序的DNA片段扩增。
2. 序列反应：将DNA片段与DNA聚合酶、起始引物和四种特殊的二进制核苷酸（即各种类型的氮碱基）一起反应，使DNA聚合酶在复制DNA过程中停止。
这些停止的位置代表了DNA序列中的不同碱基。
3. 凝胶电泳：将反应产物经过凝胶电泳分离，根据酶在不同位置停止的情况，可以逐个测定DNA序列。
454测序方法454测序是一种高通量测序技术，利用酶依赖法合成技术进行测序。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段与特殊的引物和酶（即磷酸巯基核苷酸转化酶）一起反应，使每个DNA片段在酶的作用下合成一链自由的DNA。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过光学信号或电信号读取DNA合成时释放的磷酸巯基核苷酸的数目和位置，从而确定DNA序列。
Illumina测序方法Illumina测序是当前最常用的高通量测序技术之一。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段和两种特殊的引物一起反应，引物与DNA片段的一端连接，形成桥式PCR产物。
然后，引物依次结合并延伸DNA链，生成补充DNA链。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过荧光信号的强度和位置来确定DNA序列。
测序方法是一种基于单分子实时测序技术的测序方法。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
微生物基因组测序技术及其应用
微生物基因组测序技术及其应用随着科技进步，微生物基因组测序技术在医学、环境、农业等领域受到广泛关注和应用。
本文将简要介绍微生物基因组测序技术的基本原理和应用场景，以及未来的发展方向。
一、微生物基因组测序技术的基本原理微生物基因组测序技术是指将微生物DNA分子逐一排列，从而得到一条由ATCG四种碱基构成的“基因序列”。
这种技术的基本原理是将DNA从细胞中分离出来，通过PCR扩增等方法得到大量的DNA片段，然后用高通量测序仪对这些DNA片段进行测序，最后将这些片段拼接得到完整的基因组序列。
目前，微生物基因组测序技术主要分为三种方法：Sanger测序技术、454逆转录聚合酶链反应测序技术和Illumina测序技术。
其中，Illumina测序技术是目前最常用的基因组测序方法之一。
二、微生物基因组测序技术的应用场景1.医学应用微生物基因组测序技术被广泛应用于临床诊断中。
如何对感染病原体进行准确快速的鉴定，是临床医生面临的一项困难。
传统的菌落培养法不仅时间长，而且不能鉴定细菌的种系，因此不能满足对临床诊断的要求。
微生物基因组测序技术可以直接从感染部位分离出细菌DNA，进行基因组测序后，通过对基因组序列的比对，快速高效地鉴定病原菌种类以及其耐药性。
同时，该技术还被应用于研究小肠细菌群的变化，对于小肠细菌感染和肠道菌群失调的诱因和机制的研究有着重要的作用。
而在抗生素的研究和开发中，微生物基因组测序技术也发挥着越来越重要的作用。
2.环境应用微生物基因组测序技术的应用不仅局限于医疗领域，也被广泛应用于环境监测领域。
通过微生物基因组测序技术，可以对环境中微生物丰度、多样性和功能进行高通量测定，揭示微生物群落结构和功能特征。
例如，饮用水中的微生物群落结构和数量分布对水质安全和人体健康有着至关重要的作用。
通过微生物基因组测序技术，可以对水中的细菌、病毒和病原真菌等微生物进行定量和定性分析，为水质监测提供有效的手段。
3.农业应用微生物基因组测序技术在农业领域的应用也越来越广泛。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种被广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术。
其原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法，能够以高通量的方式快速获取大量的基因组信息。
首先，将待测DNA样品进行首次扩增，得到大量的单链DNA模板。
然后，将这些单链DNA模板固定在微小的玻璃球上，每个玻璃球上只有一个DNA模板。
之后，这些玻璃球会被封装在一个水油混合液中的微小水滴中，每个水滴中通常只有三个玻璃球。
接下来，这些水滴会被密封在一片透明的PicoTiterPlate™中，并在一组具有不同碱基的草酸序列上进行串联测序，这些草酸序列会与模板DNA上的碱基进行互补配对。
然后，454测序仪会从PicoTiterPlate™中释放出草酸序列，当这些草酸序列与模板DNA上的碱基配对时，会释放出一定量的能量。
这些能量会被测序仪检测到，并将其转化成可视化的荧光信号。
最后，经过相应的图像处理和数据分析，就可以得到原始的测序数据。
根据荧光信号的强度和先后顺序，可以确定每个DNA模板上的碱基序列。
总结来说，454测序原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法，通过测量荧光信号的强度和先后顺序，快速获
得DNA模板的碱基序列信息。
这种技术具有高通量、高准确性和高灵敏度等特点，在基因组学领域有着广泛的应用。
下一代测序技术名词解释
下一代测序技术名词解释下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是一种高通量测序技术，能够同时对大量的DNA或RNA进行测序。
相比传统的测序技术，下一代测序技术具有更高的测序速度、更低的成本以及更强的分辨能力。
以下是一些常见的下一代测序技术名词解释：1. Illumina测序（Illumina Sequencing）：Illumina公司开发的一种基于桥式扩增（Bridge Amplification）的测序技术。
它通过光反应和荧光检测原理，将DNA片段扩增成固定桥结构，再通过碱基逐个加入的方式进行测序。
2. 454测序（454 Sequencing）：Roche Diagnostics公司开发的一种基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和微滴化技术的测序技术。
它通过将DNA片段扩增成微滴并进行逐个碱基加入的方式进行测序。
3. Ion Torrent测序（Ion Torrent Sequencing）：Ion Torrent Systems公司开发的一种基于核苷酸测序的技术。
它通过检测DNA串联上新生链中释放的质子来确定DNA序列。
4. PacBio测序（Pacific Biosciences Sequencing）：Pacific Biosciences公司开发的一种基于DNA聚合酶反应的测序技术。
它利用单分子实时测序原理，通过测量聚合酶在 DNA模板上运动的时间来确定序列。
5. Nanopore测序（Nanopore Sequencing）：Oxford Nanopore Technologies公司开发的一种基于纳米孔技术的测序技术。
它通过电流信号检测DNA/RNA分子通过纳米孔时的不同电流变化，从而实现对序列的测定。
这些下一代测序技术在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域中广泛应用，对于生物医学研究、疾病诊断和个体化医疗等方面具有重要意义。
基因组测序技术
基因组测序技术随着科技的不断进步，基因组测序技术逐渐成为生命科学和医学领域的重要工具。
基因组测序是指对一个生物个体的基因组进行全面的测序，旨在获取其完整的遗传信息。
此技术的应用范围广泛，涉及基础研究、医学诊断、疾病预防和个性化治疗等方面。
一、基因组测序技术简介基因组测序是指对生物个体的DNA序列进行测定和分析的过程。
DNA分子是生命体内储存遗传信息的载体，通过对其序列进行测序，可以了解生物的基因型和表现型。
基因组测序技术包括第一代测序技术和第二代测序技术两大类。
第一代测序技术，如Sanger测序法，是早期较为常用的测序方法。
它利用特定引物和DNA聚合酶进行DNA合成，通过分析扩增的DNA片段长度和碱基顺序来获得DNA序列信息。
然而，该方法在速度和成本上存在一定限制。
第二代测序技术的出现，如Illumina测序技术，实现了高通量测序。
该技术利用DNA扩增和片段连接的方法将DNA序列分成小片段，并在芯片上进行并行测序。
这种高通量测序方法降低了测序成本，加快了测序速度，广泛应用于基因组学研究和临床实践。
二、基因组测序技术的应用随着基因组测序技术的不断发展，其应用范围也越来越广泛。
以下是一些主要的应用领域：1. 基础研究：基因组测序技术在基础研究中发挥着重要作用。
通过对不同物种基因组序列的比较和分析，可以揭示物种的进化关系、遗传变异和基因功能等信息，为进一步研究提供基础。
2. 医学诊断：基因组测序技术在医学诊断中有着广泛的应用前景。
通过测序个体的基因组，可以为疾病的早期诊断和预测提供依据。
例如，通过测序肿瘤患者的基因组，可以精确判断肿瘤的类型和变异情况，从而指导治疗方案的选择。
3. 疾病预防和个性化治疗：基因组测序技术有助于疾病的预防和个性化治疗。
通过对个体基因组的测序，可以预测患病风险，并采取相应的预防措施。
同时，基因组测序还可以为个体提供个性化的医疗方案。
例如，根据个体基因组的信息，医生可以调整药物剂量，减少副作用并提高疗效。
测序技术及测序仪器的比较
河南农业大学本科生毕业论文（设计）题目现阶段的测序技术及测序仪器的比较学院生命科学学院专业班级2007级生物技术4班学生姓名徐志超指导教师高玉千撰写日期：2011年5月5日现阶段的测序技术及测序仪器的比较徐志超生命科学学院摘要：自sanger测序技术发明以来，经人类基因组计划的促进，测序技术有了跨越式的发展，以实验方法与实验仪器的改进为标志,测序技术经历了三代的发展，同时测序技术向着高通量测序，单分子测序，低价格测序的方向发展，目前测序技术已成为分子生物学实验中的重要的实验手段。
本文主要简单回溯了测序技术的发展历史，介绍了现阶段主流测序仪器IlluminaGA，ROCH-454，ABI 3730XL，ABI SOLID及HeliScope的原理及工作流程。
关键词：测序技术；测序仪；IlluminaGA；ROCH-454；ABI-3730XL；ABI-SOLID；HeliScope Studies on sequencing technology and sequencerXU Zhi-chaoCollege of Life SciencesAbstract:Sequencing technology has leaping developed promoted by the Human Genome Project since the Sanger sequencing technology been invented.Sequencing technology has gone through three generation by the improvement of sequencing methods and sequencer, at the same time, sequencing technology developed towards high-flux, single molecule sequencing and lower price. Sequencing technology has become the most important experimental means in molecular biology experiments currently. This paper simply reviews the historical development of sequencing technology,introduces the principle and workflow of the main sequencer.Keywords: sequencer;IlluminaGA;ROCH-454;ABI-3730XL;ABI-SOLID;HeliScope1953年Watson和Crick揭示了DNA的双螺旋结构[1]，这大大激励了人们对DNA 序列的探索。
人类基因组测序方法
人类基因组测序方法人类基因组测序是获取个体基因组的DNA序列信息的过程。
随着技术的进步，出现了多种测序方法，其中一些主要的包括：1. Sanger测序（链终止法）：这是早期使用的一种测序方法。
它基于DNA合成链的终止原理，通过使用包含具有特定荧光标记的二进制链终止核苷酸，来逐步合成DNA链并测序。
2. Illumina测序（高通量测序）： Illumina是目前最常用的高通量测序技术。
它采用桥放大法，将DNA片段固定在表面上，通过逐步合成链来测序。
Illumina技术具有高通量、较低成本和相对较短的读长等优势。
3. 454测序（Pyrosequencing）： Roche 454测序使用焦磷酸测序技术，通过测量每个核苷酸加入时释放的焦磷酸，来确定DNA序列。
然而，这个技术相对于Illumina而言，已经较少被使用。
4. Ion Torrent测序： Ion Torrent测序基于半导体芯片，通过检测氢离子的释放来确定DNA序列。
这是一种相对新的测序技术，具有快速测序的特点。
5. PacBio单分子实时测序： Pacific Biosciences (PacBio) 提供了一种单分子实时测序技术，它基于测量DNA聚合物链上的荧光来进行测序。
PacBio测序的优势之一是较长的读长，有助于解决一些基因组中的结构性变异。
6. Oxford Nanopore测序： Oxford Nanopore Technologies 提供的测序技术使用纳米孔来测定DNA序列。
这种方法具有长读长和实时测序的优势，适用于一些复杂的基因组结构。
这些测序方法有不同的优缺点，适用于不同的研究目的。
研究人员根据项目需求、预算和技术要求选择合适的测序平台。
在实践中，通常会使用多种测序方法的组合，以获取更全面的基因组信息。
454测序技术原理和流程
454测序技术原理和流程454测序技术是一种基于边合成边测序（Sequencing-by-Synthesis）原理的第二代高通量测序技术。
它于2003年由Roche公司（现被Illumina收购）推出，并在接下来的十几年中成为基因组学和转录组学研究中广泛使用的测序平台之一、下面将详细介绍454测序技术的原理和流程。
原理：454测序技术的原理基于DNA文库的融合PCR（emulsion PCR）扩增和荧光PCR测序的思想。
首先，DNA样本被切割成适当长度的片段，并在连接接头后构建成DNA文库。
然后，在微量水滴中将单个DNA片段与一组引物和酶进行PCR扩增。
每个水滴中只有一个DNA片段和其互补链，它们会形成单链的DNA模板。
接下来，这些微量水滴重新包装到小球形体内，称为水滴中合成（emulsion clonal amplification）。
在合成过程中，每个DNA模板被荧光标记的四种去氧核苷三磷酸（dNTPs）和DNA聚合酶引导下进行DNA合成。
每次加入一个碱基的dNTP，当它与DNA模板互补时，DNA聚合酶会将其连接到模板上，形成连续的DNA链。
而每个碱基加入后，会释放出焦磷酸酯，产生光信号，通过荧光探测器检测到这些光信号并记录。
这种碱基加入和荧光检测的过程会重复多次，直到DNA链达到所需长度或检测不到进一步的信号。
这样，通过记录每个碱基的荧光信号，就可以获得一条包含DNA片段顺序的测序读数。
流程：1.样本制备：首先，从样本中提取DNA，然后将其切割成适当长度的片段。
3.融合PCR扩增：将连接接头的DNA片段与引物、酶和其他反应物一起加入到微量水滴中，使每个水滴中只有一个DNA片段。
然后，在PCR反应中进行多轮扩增，使DNA片段复制为数以百万计的复本。
4.DNA合成：将融合PCR扩增产生的水滴中的DNA片段重新包装到小球形体内，形成单链DNA模板。
接着，在存在荧光标记的dNTPs和DNA聚合酶的条件下，进行边合成边测序，记录下每次碱基加入的荧光信号。
基因组学总结
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。
2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
GS FLX 测序原理：GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA 聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。
在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。
测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
第一代测序技术
序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA
nanoball sequencing）等。
高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些 文献中称其为下一代测序技术(next generation
上述方法有一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增
产物都是在空间上聚集的：原位polony法和桥式PCR法中所有的产物 都集中在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的
产物都集中在微珠的表面。真正的测序反应本身和传统测序法一样，
是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成（图6）。 本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法（sequencing by
sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得
对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可 能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。
实验过程
1.样本准备（sampon) 3.测序反应(sequencing reaction) 4.数据分析(data analysis)
微电极检测PH值的改变，转换成相应的碱基信号，最后得到DNA序列
Roche 454 的测序原理
鸟枪法建库 基于油包水PCR的微珠模板扩增 微珠加上测序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微传感器的测序芯片 在测序芯片表面，分次分别流过４种dNTP，微珠表面的核酸进行边合成边测序的反应 。每次发生聚合反应，释放出焦磷酸 焦磷酸被焦磷酸酶水解，释放出光子 光通过光纤被传递到光探头 光信号被转换成碱基信息，得到DNA序列。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代DNA测序技术，相对于第一代和第二代DNA测序技术，它具有更高的测序速度、更低的成本和更高的基因组分辨率。
三代测序技术在遗传学、生物学和医学研究等领域中起着重要的作用。
本文将对三代测序原理和技术进行详细比较。
第一代测序技术，又称为经典测序技术，是20世纪70年代末到80年代初出现的。
代表性的方法包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
这些方法都是基于DNA链延伸原理进行测序，通常需要大量的模板DNA和特定的剪切酶。
优点是准确性高，读长长，可达到1000到2000个碱基。
缺点是测序速度慢，成本高，并且需要大量的模板DNA。
第二代测序技术，也称为高通量测序技术，是在21世纪初出现的。
代表性的方法包括454测序、Illumina测序和SOLiD测序。
这些方法都是基于DNA扩增和测序的原理进行测序，通常需要少量的模板DNA。
优点是测序速度快，成本低，并且可以实现高通量测序。
缺点是读长短，通常只能达到几百个碱基，而且对于GC含量高的区域有较大的偏倚。
第三代测序技术，又称为单分子测序技术，是在2005年之后出现的。
代表性的方法包括Pacific Biosciences (PacBio)测序、Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序和Helicos测序。
这些方法都是基于单分子测序的原理进行测序，通常只需要少量的模板DNA。
优点是读长极长，可以达到数万个甚至数十万个碱基，对于复杂基因组和长读长测序有很大的优势。
此外，这些方法不需要扩增和特定的剪切酶，因此可以避免偏倚。
缺点是准确性相对较低，错误率较高。
在三代测序技术中，PacBio测序和ONT测序是目前较为成熟和广泛应用的两种方法。
PacBio测序原理是利用DNA聚合酶在测序过程中释放出的荧光信号进行测序。
当DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链时，会引起荧光信号的变化，从而实现碱基的识别和测序。
运用454焦磷酸测序技术对病原菌16S-rDNA的分析
运用454焦磷酸测序技术对病原菌16S-rDNA的分析林萍;周与华;李擎天;郭晓奎【摘要】Objective To investigate the clinical application value of sequencing for determining samples infected with pathogens. Methods Polymerase chain reaction (PCR) amplification and 454 pyrosequencing were used to detect 16S-rDNA V3 diversity of samples' pathogens. The results were compared with the results of bacterial culture. Results Sequencing can detect these genera such as Mycoplasma genus, Haemophilus genus, Mora genus and so on, which were not cultured easily in the clinical application. 9 genera could be detected by the 2 methods, and 7 of the genera were P ＜ 0. 05. Conclusions The detection sensitivities of the 2 methods are significantly different, and the clinical application of combination with bacterial culture is a kind of new trying to detect bacterium.%目的探讨运用测序技术鉴定临床感染标本中病原菌的应用价值.方法运用聚合酶链反应(PCR)扩增及454焦磷酸测序技术,对标本中病原菌16S- rDNA V3区进行多样性分析;并与细菌培养结果相比较.结果测序能检测出临床不宜培养的菌属,如支原体属、嗜血杆菌属、莫拉菌属等;9种菌属为2种方法共同检测所得,7种菌属的P值均<0.05.结论 2种方法的检测敏感性差异有统计学意义;与细菌培养相结合是临床实践中的一种新的偿试.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2011(026)006【总页数】4页(P364-367)【关键词】病原菌;16S-rDNA基因;454焦磷酸测序技术【作者】林萍;周与华;李擎天;郭晓奎【作者单位】上海交通大学医学院附属精神卫生中心检验科,上海,200030;上海交通大学医学院病原生物学教研室,上海,200025;上海交通大学医学院检验系,上海,200025;上海交通大学医学院病原生物学教研室,上海,200025【正文语种】中文【中图分类】R446.5感染性疾病病原菌的诊断是一个热点问题，对于病原菌的研究也由原来的着重阐述单菌种致病逐渐发展为分析多菌种的混合感染或协同感染[1，2]。
Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术原理
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
2007年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。
Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。
上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。
1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。
小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。
这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。
两个星期之后，Rothberg就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。
硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。
Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。
受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。
一个好汉三个帮。
在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种DNA组学技术，它可以同时完成很多DNA片段的测序，并生成大量高质量、相对低成本的核酸序列数据。
这一原理最初由Roche公司研发，属于生物信息学中的宏基因组学技术，主要用于检测和解析微生物群落和病毒等未知样本中的DNA序列，也可以用于基因组解析、转录组分析等。
454测序是根据“重测序”技术而设计的，针对每个测序模板，其原理包括样品准备、DNA扩增、碱基电泳和DNA信号检测4个步骤。
首先，将待测样品者分装到每个孔中，在每个孔中进行核酸扩增，即通过聚合酶链式反应（PCR）获得多份一样的片段，这是测序的基础；接着，将PCR产物加入到碱基电泳仪中，在特殊环境中，碱基电泳仪可以将成对碱基，即A、C、G、T分离成四条独立的带电性带，再通过电泳实现碱基的排序，并可以检测碱基的核苷酸序列；最后，将检测到的电泳信号转换成技术文件，即可以得到DNA序列了。
454测序原理的优势在于可以同时完成大量DNA序列的测序，并以此来获取很多有价值的基因组学数据。
它的灵敏性较高，可以检测极小的变异。
当检测单一基因时，454测序平台能够提供高精度的核酸序列，同时具有传统测序技术无法替代的扩增片段深度，这对后续的研究特别有用。
此外，454测序也可以检测非编码RNA，通过它可以比较不同物种的一部分序列的保守性，帮助研究者了解分子进化的过程，以及基因的结构及功能。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种高通量的测序技术，其核心原理是基于PCR扩增和荧光方法来实现。
具体操作过程如下：
1.剪切DNA：
首先，将长串的DNA分子经过特殊的酶切或机械剪切成数百个碎片，每个碎片一般长度在400-800bp之间。
2.链使用PCR扩增：
接着，将这些碎片的末端上添加连接器，并以连接器为起始点进行链使用PCR扩增放大，此时每个DNA分子就被扩增成数百万份。
3.单一DNA分子构建：
将单一的DNA分子分别放置在微小的水滴中，每个水滴只包含单一的DNA分子，然后分别分配在大量的PCR反应的微孔里面。
4.序列测定：
进行PCR扩增反应，测序端读出荧光信号并记录，每次只测定一种碱基，通常是A、C、G、T四种碱基，记录每种碱基的发光强度和出现时间。
对于每个DNA分子，都可以得到许多碱基信号的序列信息。
5.组装成序列：
经过大量的这样的测定，就可以获得巨量的碱基信息，将这些碱基信息通过计算机进行组装，就可以得到原始的DNA序列信息。
454测序原理主要有以下优点：
1.高通量：可以一次测定数百万个DNA分子，速度快、高效。
2.灵敏性：对于低浓度的DNA样品也可以进行高质量的测序，检测灵敏度较高。
3.序列长度长：能够读取长度较长的DNA序列，最长可达1kb。
4.配对末端技术：采用配对末端技术读取，可使序列可靠度更高。
综上所述，454测序原理主要是通过PCR扩增和荧光方法来实现的。
它具有高通量、灵敏性强、序列长度长等优点，因而被广泛应用于基因组研究、转录组研究、单细胞测序、微生物组等方面。
3大二代测序平台的优缺点
一、ABI的solid liiumina的SOLEX 和ROCHE/454的GX FLX，三种平台在技术特点上有什么异同？面对三种平台，该如何选择呢？简而言之：Roche 454是焦磷酸测序；Illunima Solexa是合成法测序；ABI SOLiD是连接法测序。
就读长来看：Roche 454 > Illunima Solexa > ABI SOLiD。
就Reads数来看：ABI SOLiD > Illunima Solexa > Roche 454。
就应用来看：Roche 454读长最长，便于拼接，因此在de novo测序方面有很大优势；ABI SOLiD虽然读长很短，但是Reads数最多，而且ABI独有的双色球编码技术，使得每个碱基都会被读取两遍，准确率很高，因此ABI SOLiD在检测SNP、转录组测序、ChIP-Seq等方面很有优势；Illunima Solexa的读长和Reads数均位于中间，比较适合于基因组重测序。
而在实际应用中，由于Roche 454成本太高，因此Illunima Solexa 也被较多的应用于de novo测序。
二、关于生物芯片和二代测序1：现在二代测序很火，有一种取代芯片的趋势，我想知道，生物芯片和二代测序各自的优缺点？2：什么样的研究，使用芯片更好?什么样的测序更好？3：关于不同的测序平台，测的长度不同，有什么样区别？4：什么是数字表达谱？microarray和NGS都是高通量的基因组学研究手段，两者还是有较显著的差异。
首先，根本机制不同，Microarray本质上是核酸杂交；NGS本质上是PCR。
其次，microarray是一个封闭的系统，不可能检测到探针没有覆盖到的那部分信息；而NGS是一个开放的系统，来什么，测什么。
（1）microarray不能发现新序列，而NGS可以发现一些以前没有检测到的基因。
（2）由于NGS本质上还是PCR，在建库的过程中样本被扩增上千倍，因此样本中基因的量的线性关系会有所偏差。
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工作流程
五.测序 携带DNA的捕获磁珠（20um）随后放入 PTP板（Pico TiterPlate）的微孔（29um）中 Pico TiterPlate） 进行后继的测序反应。此反应释放出的光信号 实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有 一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一 分子的光信号。由此一一对应，就可以准确、 快速地确定待测模板的碱基序列。
工作流程
六.数据分析 454测序系统可以在10小时的运行当中获 得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信 息。并提供两种不同的生物信息学工具对测序 数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。
454测序系统图示 454测序系统图示
A为液体试剂供应装置 B为反应池 C为光线检测成像系统和计算机 控制系统
工作流程
三一个磁珠携带样就形成了只包 含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
工作流程
四.乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行 独立的扩增，而没有其他增后产生了几百万个 相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增 的片段仍然结合在磁珠上。
测序原理
经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被 放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序， 每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦 磷酸，然后焦磷酸和腺苷酰硫酸在磷酸化酶的催化 下生成ATP，然后荧光素酶就可以在ATP参与下将 荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器 检测到。
工流程
新一代测序技术
—— 454基因组测序技术
报告人：钱龙 组员：郭斌 邓娟 梁敏 高婷婷 专业：生物化学与分子生物学
背景介绍
DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程，它已广泛应 用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通 量DNA测序技术予以解决。 迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于 Sanger测序法获得的。但在过去几年，大规模平行测序平台 （massively parallel DNA sequencing platform massively platform）已经发展为 主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降 到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测 序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技 术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据 库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。 新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全 面、更深入地分析基因组、转录组及蛋片制备
焦磷酸测序
加入含酶小微珠
工作流程
一.样品输入并片段化 大的样品例如基因组DNA或者BAC等被 打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非 编码RNA或者PCR扩增产物，这一步A 和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测 序步骤。具枪Sanger 测序法策略
图b为鸟枪循环芯片测序法 策略
测序原理
在体外构建好的两端带接头的单链DNA在 一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增，因为起始 阶段模板浓度非常低，因此，大部分包还有磁珠的 为乳液滴都只含有一种模板，经PCR扩增后，每个 磁珠只连有一种模板的扩增产物，然后打破为乳液 滴，收集磁珠，加入芯片中。
测序策略
454基因组测序使用了一种新的测序策略——循 环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将 其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。 所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA DNA 样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板 变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反 应。 与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作 更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广 泛的应用。
测序质量
454测序技术的准确率在99%以上。其主 要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺 入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻 止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要 从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生 误差。因此，454测序平台的主要错误类型是 插入-缺失。
总结
454测序结果的数据质量高，且分析简单 。其多种多样的应用彰显出它强大的能力，那 些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也 可以一并解决了。超长读长与易用的分析工具 相结合，让研究人员能更集中精力于科学研究 ，而不是研究测序过程中的某个技术细节。这 样研究项目能快速完成，接着踏上新的研究道 路。
谢谢观看