2014 根系活力测定(4种)

2. TTC又名红氮四唑，标准氧化还原电位为-80mv。 3. 三苯基甲腙（TTF triphenyl formazan）红色 4. TTC是用HCl配制的，当它溶于水中，pH为3~5，因此要
加入等体积的0.1M pH7.5的磷酸缓冲液（该实验用的为 1/15）。这样反应液的pH为6.8左右。如不用，TTC反应 液过酸，会杀死根。另外TTC加磷酸缓冲液后要避光，最 好临时配制使用，在暗处保存时间要短。否则见光会变红， 影响反应的准确性。
在试管中加入95%乙醇至5 mL刻度线 ，沸水水浴抽提10 min，冷却后用95%乙醇定容至5mL刻度线 （如果颜色深可 以增加体积，以便比色，两个处理定容体积一致），溶液混 匀后，在530 nm处测定吸光值（水为空白比色）。根据OD 值计算根系相对活力（B÷A) ×100%。
2. Evans blue ： A、B两组分别0.3 g根尖段放入15ml试管中 （标号为EA、EB），加入6 mL0.125％ Evans blue 染色液 染色，15min后将Evans blue染色液倾倒回公用烧杯（回 收！！），随后用水充分洗净根系表面色素（冲洗3-5次）。
实验原理
1. TTC法：
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准的氧化还原色素， 其氧化态无色并溶于水，还原态则是不溶于水的三苯 基甲腙（TTF）红色物质，它在空气中不会自动氧化、 相当稳定。根系细胞中脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶） （或活细胞的NADH，NADPH）可பைடு நூலகம்为TTC的氢供体， 从而将TTC还原为TTF。外加琥珀酸可增强TTC的还原。
3. FDA方法※
FDA ：二乙酸荧光素（Fluoresencein diacetate，母液为 5 mg/mL的FDA DMSO溶液，储存在0℃） FDA是一种非极性酯类物质，可以通过质膜进入细胞质， 在细胞内酯酶的作用下水解脱去酯基团后在490-500 nm 激发光下产生绿色荧光。 FDA （2µg/mL）被普遍用于细胞活力的测定 活力低的细胞具有较低的酯酶活性，因此绿色荧光较弱
实验步骤
将幼苗分为两组: 一组为对照（处理A ）；另外一组根 系浸没于沸水浴 20 min（处理B）。A、B两组处理结 束后分别剪取根尖段（一般2cm），用吸水纸吸干表 面水分，备用（估称一下重量）
注意：地上部需保留，作为下一次实验的材料
1. TTC法：A(Control)、B(Treatment, 热伤害)两组分别称取 0.30 g根放入15 mL刻度试管（带盖的塑料离心管），在试 管中加入10mL反应液（0.4%TTC溶液和0.067mol/L磷酸缓 冲液的等量混合液，pH6.8） ，（盖盖）混匀，在37ºC水浴 中反应1 h（水浴浸没反应体系液面）。随后加入0.5 mL 2 M H2SO4中止反应（混匀），2min 后排干试管中的溶液，并用 水冲洗2次（防止根丢失、冲掉）。
制作标准曲线：
吸取0.4%TTC（0.4g/100mL）溶液0.2ml放入10mL容量瓶； 加少许（大约至少半大的大豆） Na2S2O4粉末，摇匀后产 生红色的TTF，再用95%乙醇定容至刻度摇匀（相当于 TTC 80g/mL）。从其中分别取0.25、0.5、1.0、1.5、 2.0ml置于5个10ml容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。此 时TTC含量分别为2、4、8、12、16g/mL。以95%乙醇 为空白，用分光光度计在530nm波长下测定光密度。以光 密度为横坐标、以TTC含量为纵坐标，绘制标准曲线。
3. FDA方法※
剪去小麦根尖（6条）浸泡在1mL（浓度为2µg/mL ）
的FDA溶液15分钟 去离子水清洗附着染料后，放在荧光显微镜下进行观察 摄影（Leica荧光显微体视镜，激发光490nm）; FDA母液为储存在0℃、5 mg/mL的FDA DMSO溶液 荧光显微镜在C1007
4. 碘化丙啶分子荧光法
Reference: De Cnodder et al., 2005. Regulation of cell length in the Arabidopsis thaliana root by the ethylene precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid: a matter of apoplastic reactions. New Phytol, 168: 541–550
将处理好的植物根尖样品放进1mL(3μg/mL)的PI溶 液之中10 min ， 取出后用去离子水冲净3-4次， 置于荧光显微镜下，在546 nm波长激发紫外光下观 察、拍照。
注意： 奇数组做FDA荧光法 偶数组做PI分子荧光法
注意事项
1. 根所能引起的TTC的还原可因及入琥珀酸、延胡索酸、苹 果酸得到加强。而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。
死细胞因为不具有酯酶活性所以不会发出绿色荧光。
Reference: Ishikawa S and Wagatsuma. 1998. Plasma membrane permeability of root-tip cells following temporary exposure to Al ions is a rapid measure of Al tolerance among plant. Plant Cell Physiol, 39(5):516-525
2. Evans blue染色法
是一种检测细胞死活的染料 质膜完整性可以通过对Evans Blue的吸收情况来衡量 Evans Blue只能透过被破坏后透性增加的质膜进入细胞， 而正常细胞的质膜则可以阻止Evans Blue的进入
Reference: Yamamoto et al., 2001. Lipid peroxidation is an early symptom triggered by aluminum, but not the primary cause of elongation inhibition in pea roots. Plant Physiol, 125:199-208
实验10 植物根系活 力的测定
实验目的
植物根系是水分和矿质营养的主要吸收器官，也是多种物 质（如氨基酸、植物激素、生物碱等）的同化、转化或合 成的重要器官，因此，根系的生长发育状况和根系的活力 强弱将直接影响植物的生命活动，根系活力是植物生长的 重要生理指标之一。 试验测定方法的多样性、实用性与可靠性 如：TTC、Evans blue、萘胺法、FDA、甲烯蓝法、PI等方法
定性观察： 从A、B两组管中分别取出2个根尖段(仅1CM,余 放回），在体式显微镜下观察根尖部分着色情况（在C1007 操作）。
定量测定：将上述洗净根系表面色素根系分别加入3 mL N,N二甲基甲酰胺 中1 h，混匀，于600 nm处测定溶液吸光值。 根据OD值计算根系相对活力: 计算[(B-A) ÷A]×100%值。
2. Evans blue
染料，质膜完整性、生物膜的通透性
图1 不同伤根处理后根尖Evans blue 染色图 Figure 1 The cell viability test determined by Evans blue staining in
roots tips after different root damage 0.1mol·L-1的HCl预处理（F）、根尖浸与65°C水浴中2 h预处理（C）
不同浓度Al处理后三 个品种小麦根尖细胞 活力的变化 A：扬麦9号； B：Scout 66； C：Atlas 66；
µmol/L
4. 碘化丙啶分子荧光法
根尖质膜完整性测定：通过不透膜的分子荧光探针碘化丙 啶（Propidium iodide, PI）来完成。 PI能够与核苷酸相结合，通过用来标记失去膜完整性的细 胞（De cnodder等，2005），活细胞不被标记。 将处理好的植物根尖样品放进3μg/ml的PI溶液之中，10min 后取出冲净，立即置于荧光显微镜下，在546 nm波长激发 紫外光下观察、拍照。