论文

摘要：异迟眼蕈蚊是食用菌主要栽培区双翅目害虫的优势种之一，分析食用菌在受到异迟眼蕈蚊危害前后有关酶活性的变化,探讨了过氧化物酶( POD)、过氧化氢酶( CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)。

眼蕈蚊科（Sciaridae）是野生食（药）用菌眼蕈蚊中最常见的一类害虫。眼蕈蚊科中为害食用菌的约有20 种，主要有厉眼蕈蚊属（Lycoriella）、迟眼蕈蚊属（Bradysia）、模眼蕈蚊属（Plasosciara）等。危害食用菌的眼蕈蚊研究主要集中在平菇厉眼蕈蚊（Lycoriellapleuroti），该虫是国内危害食用菌的优势种之一，俗称菌蚊、菌蛆。异迟眼蕈蚊（Bradysiadifformis）是迟眼蕈蚊属的一个种，是国外食用菌菇房内的主要双翅目害虫之一。[1]异迟眼蕈蚊Bradysiadifformis Frey 是食用菌菇房内的主要害虫。因其体形小，为害隐蔽，繁殖能力强，难以在危害早期被察觉，一旦发现成虫，大部分菌棒都已受害。[2]

目前对眼蕈蚊的防治以化学防治为主，而食用菌上残留的药剂对人体有毒害作用。探索高效、无毒、无污染防治异迟眼蕈蚊的新方法、新途径具有一定科学意义和应用前景。研究食用菌受异迟眼蕈蚊危害后防御酶的影响。从而为以后筛选出抗异迟眼蕈蚊虫害有一定帮助。

1实验材料与方法

1.1 试验设计

三种不同的食用菌，分别同样条件下，同样的品种，分别放在蚊帐中给蚊虫咬食和放在外界不被咬食，一段时间后测SOD，CAT，POD的活性。

酶液的提取称0. 5 g鲜样,加 1 mL磷酸缓冲液( 0. 05 moL /L, pH7. 8)冰浴研磨,研磨后再加1 mL缓冲液,倒入离心管中,再用2 mL缓冲液冲洗研钵。在10 000 r /min下低温( 0～4℃)离心10 min,上清液即为所需酶液.

1.实验仪器与用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、微量移液枪、离心管、光照箱（光照度为4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）

2.实验试剂

0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。

酶提取缓冲液：称取77mg DTT、5g PVP，加入0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8），定容至100ml，摇匀，即得提取缓冲液（含5mmol/L DTT和5% PVP），低温（4℃）

贮藏备用。

50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。

130mmol/L L-蛋氨酸（MET）溶液：称取1.94g L-蛋氨酸，用50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解，定容至100ml，充分混合（现用现配）。低温避光保存，可使用2~3d。

750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.3mg NBT，用蒸馏水溶解，定容至100ml，充分混匀（现用现配）。低温避光保存，可使用2~3d。

100μmol/L Na2-EDTA溶液：称取37.2mg Na2-EDTA，用蒸馏水溶解，定容至100ml，使用时稀释100倍。低温避光保存，可使用8~10d。

20μmol/L 核黄素溶液：称取75.3g核黄素，用蒸馏水溶解，定容至100ml，使用时稀释100倍。低温避光保存，即用黑纸将装用该液的棕色瓶包好，现用现配。

3.实验材料

经逆境处理的绿豆幼苗、芹菜或茶叶

【实验步骤】

1.酶液制备

取材，称取5g样品，置于研钵中，加入5ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、12000g离心30min，收集上清液，低温保存备用，测量提取液总体积。

2.活性测定

用5支玻璃管进行测定。按照表1所列内容加入各种溶液（注意最后加入核黄素溶液）。其中3支为测定管，2支对照管。混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应下反应15min后，立即置于暗处终止反应。以避光管作为空白参比调零，分别测定560nm处其他各管的吸光度。

表1 测定SOD活性时各试剂加入量

试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8） 1.7

130mmol/L L-蛋氨酸（MET）溶液0.3 13mmol/L

750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液0.3 75μmol/L 100μmol/L Na2-EDTA溶液0.3 10μmol/L

20μmol/L 核黄素溶液0.3 2.0μmol/L

酶液0.1 对照2支试管以缓冲液代

总体积 3.0

【实验报告】

1.测定数据记录

重复次数样品

质量

m/g

提取液

体积

V/ml

吸取样

品液体

Vs/ml

560nm吸光度样品中SOD活性/U

ODc ODs 计算值

平均值±标准

偏差

1

2

3

2.计算

显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODs）和照光对照管反应混合液的吸光度（ODc）。以每分钟每克植物组织（鲜重）的反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%为一个SOD活性单位（U）表示。

SOD= 式中，ODc

ODs为样品管反应混合液的吸光度；

V为样品提取液总体（ml）；Vs为测定时所取样品提取液体积（ml）；t为光照反应时间（min）；m为样品质量（g）。

也可以每分钟反应体系对氮蓝四唑（NBT）光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位（U）。

[1] 张宏瑞, 张晓云, 沈登荣, et al. 食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性[J]. 中国食用菌, 2008, (06): 54-56.

[2] 张爽, 张绍勇, 赵应苟, et al. 异迟眼蕈蚊成虫行为学特征及性信息素初步研究[J]. 应用昆虫学报, 2014, (04): 1069-1074.