临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理
临床基因扩增检验实验室工作规范
为使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务,保证检验质量,特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002】10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。
为避免污染,必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区,避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。
此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。
在打开含有反应混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用,避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。
临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理
临床基因扩增检验实验室的规X化设置及其管理使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗效劳，保证检验质量，特制定本规X。
一、临床基因扩增检验实验室的规X化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规X化设置详见?临床基因扩增检验实验室管理暂行方法?(卫医发[2002]10号文附件?临床基因扩增检验实验室根本设置标准?。
为防止污染，必须严格遵循?临床基因扩增检验实验室设置标准?设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记，以防止设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反响混合物配制和扩增区(简称扩增区至产物分析区，防止发生穿插污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。
此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进展。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止穿插污染。
(一)<试剂贮存和准备区下述操作在该区进展：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反响混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。
在翻开含有反响混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，防止由于经常翻开反响管吸液而造成污染。
含反响混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为防止因单次反响取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反响数来决定。
临床基因扩增实验室管理和质量保证
失控的可能原因
弱阳性质控样本 核酸提取过程中的随机误差 仪器 试剂
阴性质控样本 扩增产物的污染 核酸提取过程中标本间的交叉污染
• THANK YOU!
临床基因扩增检验的室内质量控制
分析前的质量控制
实验室的正确设置 仪器、设备的管理 试剂质量 人员培训 规范操作
分析中的质量控制
常规检测临床标本的同时，测定一份或连续 测定数份含一定浓度分析物的质控样本，用 统计学方法判断质控样本的检测结果是否偏 出允许范围，进而决定常规标本检测结果的 有效性。
必须注意空气流向（通过实验室的空气压力 而实现）缓冲室：负压源自用于更换工作衣和工作鞋) 实验室：常压
各功能区内设置相应的仪器和设备 模板制备区设生物安全柜 各功能区内的任何物品不可移至其它功能区
原则： 各功能区互相独立 设缓冲间, 保持区域间完全分隔 各区物品专用
临床基因扩增检验实验室必须经过国家有关 部门的验收认可
（稳定可靠的质控品 切实可行的统计方法）
稳定可靠的室内质控物
质控样本的基质与待测样本一致 所含待测物浓度应接近试验的决定性水平
定性检测：检测的阳性判断值 定量检测：检测浓度范围的下、上限 稳定性、生物安全性 已知靶值或预期结果 单批量大、廉价
每次扩增必须设置监测污染发生的阴性 质控
切实可行的统计方法
必须遵循申报程序
（扫描程序）
第二节 临床基因扩增实验室的质量保证
室内质量控制 （internal quality control, IQC）
室间质量评价 （external quality assessment, EQA）
标本的采集、运送、保存及其质量控制
按检测要求建立标准操作程序和质量控制 规则
临床基因扩增检验实验室的设置质量管理体系的建立及其技术验收
产物分析区
核酸扩增后产物分析方法,如膜上或微孔板上 探针杂交方法,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝 胶电泳,核酸测序等方法。
本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必 须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增 产物带出。由于本区有可能用某些可致基因 突变和有毒物质，故应注意实验室人员的安 全防护。
卫检字2002第8号
临床基因扩增检验实验室技术验收申请表
一.基因扩增实验室基本情况 二.提供材料情况（十部分）
《医疗机构执业许可证》 拟设置基因扩增实验室医院医疗资源状况、对该检 测的需求及实验室运行的预测分析 拟设置基因扩增实验室的设置平面图 实验室主要负责人简历表 实验室工作人员一览表
临床基因扩增检验实验室技术验收申请表
试剂准备区
试剂分装应在超净台中进行 扩增反应混合液应使用分子生物学级的，试
剂制备好后应有质检： 一是否有污染（是否 有假阳性存在）、二是使用弱阳性质控物检 测试剂的扩增效果。
标本制备区
仪器设备配置标准：
生物安全柜 ， 2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰 箱；高速台式冷冻离心机；混匀器；水浴箱或加 热模块；微量加样器（覆盖1～1000µl）；可移动 紫外灯（近工作台面）；超净工作台，消耗品； 一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心 管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作 鞋；专用办公用品等。
样品处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的 核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进 行评价。
标本制备区
温育既可在加热模块也可在水浴中进行。加 热模块和水浴应在每次使用时，都要对所设置 的温度使用已经校准的温度计进行校准。
医疗机构临床基因扩增检验试验室管理办法及医疗机构临床基因扩增检验试验室工作导则
医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法发布部门：卫生部发布文号：卫办医政发[2010]194号第一章总则第一条为规范医疗机构临床基因扩增检验实验室管理，保障临床基因扩增检验质量和实验室生物安全，保证临床诊断和治疗科学性、合理性，根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》，制定本办法。
第二条临床基因扩增检验实验室是指通过扩增检测特定的dna或rna ,进行疾病诊断、治疗监测和预后判定等的实验室，医疗机构应当集中设置，统一管理。
第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验技术的医疗机构。
第四条卫生部负责全国医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。
各省级卫生行政部门负责所辖行政区域内医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。
第五条以科研为目的的基因扩增检验项目不得向临床出具检验报告，不得向患者收取任何费用。
第二章实验室审核和设置第六条医疗机构向省级卫生行政部门提出临床基因扩增检验实验室设置申请，并提交以下材料：《责验收行政部门执业许可证》（一）《医疗机构执业许可证》复印件;（二）医疗机构基本情况，拟设置的临床基因扩增检验实验室平面图以及拟开展的检验项目、实验设备、设施条件和有关技术人员资料；（三）对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析。
第七条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定的其他机构（以下简称省级卫生行政部门指定机构）负责组织医疗机构临床基因扩增检验实验室的技术审核工作。
第八条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构应当制订医疗机构临床基因扩增检验实验室技术审核办法，组建各相关专业专家库，按照《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》对医疗机构进行技术审核。
技术审核办法报请省级卫生行政部门同意后实施。
第九条医疗机构通过省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构组织的技术审核的，凭技术审核报告至省级卫生行政部门进行相应诊疗科目项下的检验项目登记备案。
临床基因扩增检验实验室的设置、质量管理
实验室使用和管理：
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标本接受区
试剂准备区
样本制备区 扩增区
产物分析区
区域的适当合并： “由于测定技术总是在发展之中，
区域的合并应根据仪器的特点而定”
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小结：
从核心仪器特点、实验室的现状出发，综 合考虑管理要求
有关职责进行审核。
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管理要求（现场考核）：
送审的文件描述与实验室实际情况的一致 性
实际运行与文件规定的一致性 人员素质：对文件的认知、熟悉、灵活运
用程度
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现场考核的实际内涵： 认识到不到位 落实到不到位 符合性检查加指导性检查 有重点的全面检查
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标本制备区：
临床标本的保存
核酸提取、储存及
其加入至扩增反应 管
测定RNA时cDNA的合 成
不得在本区对样本进 行PCR扩增
冰箱 (2~8℃和-20℃或-80℃) 高速台式冷冻离心机
水浴箱和/或加热模块 生物安全柜 混匀器
微量加样器 可移动紫外灯 专用工作服和工作鞋
四个组成部分的关系：
关键：核心——过程（活动） 纽带——程序组织结构 Nhomakorabea程序
资源
过程
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过程
理解
“过程”的重要性 1、工作是通过过程来完成的。 2、质量管理是通过对各种过程的控制 来实现的。 3、质量管理本身也是一系列的过程
过程的分解、控制 过程的有机组合
临床基因扩增检验实验室工作规范
临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。
为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。
此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。
在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
临床基因扩增检验实验室管理制度
临床基因扩增检验实验室管理制度
一、目的：
强调严格按照卫生部临检中心关于基因扩增检验实验室的规定进行实验室管理和实验操作，确保检验的质量，实施实验室标准化管理制度。
二、适用范围：
临床基因扩增检验实验室。
三、职责：
由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、要求：
1、临床基因扩增检验实验室工作人员应具备医学检验、微
生物学检验及分子生物学基本知识、大中专以上学历、并受过临床基因扩增实验的基本知识和技能培训。
2、临床基因扩增检验实验室的各区应有专用的实验设备（含
工作服、加样器、试管架、吸头、记录纸、笔等），不得混用，须贴上标签予以区别。
3、实验室工作人员必须严格按照临床基因扩增实验操作程
序进行，包括实验室擦洗、台面消毒，离心管、吸头的无菌灭活准备，仪器使用和废弃物处理等。
4、进入实验室后区的物品不许带回实验室前区。
5、每天实验开始前，必须清洁地面和消毒实验台面。
6、定期校准和维护核酸扩增仪、加样器、水浴箱等仪器设备。
7、进入实验室的工作人员必须遵守实验室的唯一流向规定，
严禁反向流动。
8、进入实验室，必须更换本室各区专用的工作服、拖鞋，
每周两次换洗工作服。
9、实验室不得饮食、吸烟、会客。
10、实验结束后开紫外灯消毒实验室及台面30～60分钟。
11、每天下班前处理好废弃物品，关好水、电、和门窗。
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则一、前言随着科技的不断发展，基因扩增检验技术在医学领域的应用越来越广泛。
为了确保基因扩增检验实验室的工作质量和准确性，提高检测结果的可靠性，我们制定了本《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。
本文将从实验室的基本要求、实验操作流程、质量控制和安全管理等方面进行详细阐述，以期为我国医疗机构临床基因扩增检验实验室的工作提供参考。
二、实验室基本要求1.1 实验室布局实验室应设立专门的实验区域，包括试剂准备区、标本处理区、仪器操作区和废弃物处理区等。
各区域之间应保持一定的距离，以确保实验操作的安全性。
实验室应设置合理的通风设备，确保实验室内空气的流通。
1.2 仪器设备实验室应配备先进的基因扩增检验仪器设备，如PCR仪、实时荧光定量PCR仪等。
仪器设备应定期进行校准和维护，确保其性能稳定可靠。
实验室还应配备相应的试剂和耗材，以满足实验需求。
1.3 人员配备实验室应有专业的技术人员负责实验操作和数据分析工作。
技术人员应具备扎实的专业知识和丰富的实践经验，能够熟练操作各类仪器设备和处理实验数据。
实验室还应设有管理人员，负责实验室的日常管理和质量控制工作。
三、实验操作流程2.1 标本采集与处理患者需按照医生的要求进行标本采集，如血液、唾液、尿液等。
采集后的标本应及时送至实验室进行处理。
标本处理过程中应注意避免污染，确保标本的完整性和准确性。
2.2 试剂准备根据实验需求，选择合适的试剂和耗材进行准备。
试剂准备过程中应严格按照说明书进行操作，确保试剂的质量和纯度。
应对试剂的使用量和保存条件进行记录，以便后续分析。
2.3 实验操作根据实验方案，使用相应的仪器设备进行实验操作。
实验操作过程中应严格遵守操作规程，确保实验的准确性和可靠性。
应对实验数据进行实时监测和记录，以便后续分析。
2.4 结果分析与报告实验完成后，应对实验数据进行分析，得出相应的检测结果。
分析过程中应遵循相关标准和规范，确保结果的准确性。
临床基因扩增检验实验的设置、管理和技术验收(新)
卫生部临床检验中心 李金明
临床基因扩增检验实验室的设置
依据：卫生部颁发的《临床基因扩
增检验实验室管理暂行办法》（卫 医发[2002]10号）
临床标本的接收
通常的工作流程：标本采集
编号 保存或检测
血清分离
应在四个测定区域之外的地方或区域内 接收 接收的标本应收集在原始容器中 在核酸提取时带入至标本制备区
记
录
本章包括三条。 有记录管理制度：适合自身实际情况，符 合现行规章制度；（由谁管、在何处管、 保存多长时间） 原始记录、计算和导出数据应归档并保存； 记录应有有关人员的签字； 所有记录和报告都要妥善保管并保密。
报
告
检测结果的报告应准确、清晰和客观； 定性测定报告“阴性”或“阳性”；定量测定则 以拷贝数/ml或IU/ ml报告；避免二者之间的混 淆； 每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检 测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和 检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发 出日期、参考结果或范围； 如对报告有效性有疑问，实验室应立即通知临床 相关科室予以改正的程序； 有报告的发放程序：用电话、传真、电子邮件报
实验室的日常工作管理
工作项目
水浴箱、微量恒温器（加热模块） 次氯酸钠溶液 生物安全柜 室内质控 弱阳性质控（定性） 低、中、高浓度质控（定量） 阴性质控：原样本 经历提取过程的空管 仅含扩增反应混合液管 实验台面
核查点
□校准及记录温度 □新鲜配制 □先起动运行30分钟后再开始工作 □有 □有 □有 □有 □有 □使用后用次氯酸钠溶液消毒， 再用70%乙醇清洁 □紫外照射 □使用后用次氯酸钠溶液消毒， 再用70%乙醇清洁 □遵循单一工作流向 □紫外照射
临床基因扩增检验实验室基本设置标准
临床基因扩增检验实验室基本设置标准根据《临床检验扩增检验实验室管理暂行办法》，制定本标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则（一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和准备区2、标本制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。
（二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
（三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区一＞标本制备区一＞扩增反应混合物配制和扩增区一＞扩增产物分析区。
（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。
工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
二、工作区域仪器设备配置标准（一）试剂储存和准备区1、2-8C 和-15C 冰箱2、混匀器3、微量加样器（覆盖1-10ul4、移动紫外灯（近工作台面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品（二）标本制备区1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器（覆盖1-10ul6、可移动紫外灯（近工作台面）7、超净工作台8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。
（三）扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器（覆盖1-10ul3、可移动紫外灯（近工作台面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品（四）扩增产物分析区视检验方法不同而定。
基本仪器设备如下：1、微量加样器（覆盖1-10U12、可移动紫外灯（近工作台面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品为了对以个特定序列进行PCR做重复检测，需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：1）PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。
临床基因扩增检验实验室基本设置标准
临床基因扩增检验实验室基本设置标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则（一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和准备区2、标本制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。
（二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
（三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区—>标本制备区—>扩增反应混合物配制和扩增区—>扩增产物分析区。
（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。
工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
二、工作区域仪器设备配置标准（一）试剂储存和准备区1、2-8C和-15C冰箱2、混匀器3、微量加样器（覆盖1-1000ul）4、移动紫外灯（近工作台面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品（二）标本制备区1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器（覆盖1-1000ul）6、可移动紫外灯（近工作台面）7、超净工作台8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。
（三）扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器（覆盖1-1000ul）3、可移动紫外灯（近工作台面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品(四)扩增产物分析区视检验方法不同而定。
基本仪器设备如下：1、微量加样器（覆盖1-1000ul）2、可移动紫外灯（近工作台面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品临床标本接收区如果在标本接收区分离血清（浆）标本，有1台分离血清（浆）用离心机、1台生物安全柜、1台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理的消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。
医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法
医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法(卫办医疗政发〔2010〕194号）第一章总则第一条为规范医疗机构临床基因扩增检验实验室管理，保障临床基因扩增检验质量和实验室生物安全，保证临床诊断和治疗科学性、合理性,根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》，制定本办法。
第二条临床基因扩增检验实验室是指通过扩增检测特定的DNA或RNA，进行疾病诊断、治疗监测和预后判定等的实验室,医疗机构应当集中设置，统一管理。
第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验技术的医疗机构。
第四条卫生部负责全国医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。
各省级卫生行政部门负责所辖行政区域内医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。
第五条以科研为目的的基因扩增检验项目不得向临床出具检验报告,不得向患者收取任何费用。
第二章实验室审核和设置第六条医疗机构向省级卫生行政部门提出临床基因扩增检验实验室设置申请，并提交以下材料：(一）《医疗机构执业许可证》复印件；（二）医疗机构基本情况,拟设置的临床基因扩增检验实验室平面图以及拟开展的检验项目、实验设备、设施条件和有关技术人员资料；(三）对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析。
第七条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定的其他机构(以下简称省级卫生行政部门指定机构）负责组织医疗机构临床基因扩增检验实验室的技术审核工作。
第八条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构应当制订医疗机构临床基因扩增检验实验室技术审核办法，组建各相关专业专家库,按照《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》对医疗机构进行技术审核。
技术审核办法报请省级卫生行政部门同意后实施。
第九条医疗机构通过省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构组织的技术审核的,凭技术审核报告至省级卫生行政部门进行相应诊疗科目项下的检验项目登记备案。
第十条省级卫生行政部门应当按照《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗机构临床检验项目目录》开展医疗机构临床基因扩增检验项目登记工作。
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临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。
为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区至产物分析区，避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。
此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一)<试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。
在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。
对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶 )，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。
在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。
此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。
严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。
工作结束后必须立即对工作区进行清洁。
本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。
实验台表面的紫外照射应方便有效。
由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。
由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。
实验室及其设备的使用必须有日常记录。
(二)标本制备区下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。
要正确使用加样器。
由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。
可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。
为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。
对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。
用过的加样器吸头必须放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。
实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等)如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。
对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近距离)适合于灭活去污染。
可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。
样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。
用于RNA扩增检测样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。
为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。
cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。
待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。
(三)扩增区下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。
此外，已制备的DNA模板和合成的cD NA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。
在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。
不能从本区再进入任何"上游"区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。
为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。
如有加样则应在超净台内进行。
打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。
一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。
可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。
防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。
用过的加样器必须注意清洁消毒。
完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。
如有溶液溅出，必须处理并作出记录。
(四)扩增产物分析区下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。
核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。
目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即P CR-ELISA方法，也有膜上探针杂交方法。
本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。
在使用 PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1mol/L HC1中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的地方弃掉。
用过的吸头也必须放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。
由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。
本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。
本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。
二、临床基因扩增检验实验室质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。
(一)标本的采集;常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。
采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。
当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。
采样时必须戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。
最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。
EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。
不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。
临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆，以避免RNA的降解。
如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。
(二)标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。
由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。
异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和R NA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5m ol/L GITC的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。
经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。
对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。
(三)标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。
经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。
如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本。
通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。
用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。
(四)标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。
用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。
用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。
用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。
用GITC处理的RN A标本在室温可保存7天。
(五)标本的处理(核酸提取)标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。
通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身(如血红素及其前体或降解产物)或核酸提取过程中残留的有机溶剂(如酚、氯仿等)，这些物质对其后的 T aq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。
当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。
需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。
此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA酶的污染。
对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有R NA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。
对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。
(六)靶核酸的逆转录(RT)和扩增1、靶RNA的逆转录cDNA合成为逆转录PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA为靶RNA的反向互补链，为后面扩增的模板。
下述因素通常影响cDNA合成的效率：(1)逆转录效率的降低或完全缺乏。
其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等;(2)用于逆转录的标本中存在逆转录或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等);(3)RNA酶的存在导致RNA的降解。