中文操作手册 phosflow 小鼠脾细胞 胸腺细胞-9
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小鼠脾细胞/胸腺细胞BD Phosflow™ 操作流程
Protocol I (Detergent Method)
所需试剂:
试剂准备:
按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer (货号:558049)。使用前37°C 预热15-30分钟。
按照说明书用双蒸水稀释制备1 x Perm/Wash Buffer I (货号:557885)。放置至室温后使用。
操作步骤:
1.取小鼠组织样本(如脾脏,胸腺,骨髓等),用PBS或完全培养基制备单细胞悬液
2. 350g 离心6- 8 分钟,弃上清
3. 混匀细胞(此步动作需要轻柔)
4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. (选做步骤)因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激,所以有些细胞需要在前处理完成后,可以在完全培养基中静息2-4小时,以保证细胞恢复到未受刺激状态(参见操作说明)。
6. 用适当的刺激剂处理细胞,37°C 孵育适当的时间(1到30分钟,参见操作说明)。实验需设
立未处理样本为阴性对照。
7. 刺激处理完毕后,迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振
荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11. 细胞清洗:
a.加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer试剂(货号:554656)。
b.600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
c.振荡器低速振荡混匀细胞。
12.(选做步骤):为保证实验结果,若以上步骤红细胞裂解不充分,继续用溶血剂裂解细胞,
但此步骤不得超过2次。
13. 于1–10 x 10^6细胞中加入1ml (最少1ml)Perm/Wash Buffer I进行细胞破膜。轻柔混匀后,室温孵育15-30分钟。
14. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
15.振荡器低速振荡混匀细胞。
16. 细胞清洗:
a.加入与1ml Perm/Wash Buffer I。
b.600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
c.振荡器低速振荡混匀细胞
17. 用Perm/Wash Buffer I重悬细胞,使细胞终浓度为5–10 x 106 cells/mL。
18. (选做步骤)每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体(货号:553141 or 553142)。混匀
后冰浴15分钟。
19. 取100 μL 细胞悬液(0.5–1 x 10^6细胞)置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中,参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
20. 混匀后室温避光孵育60分钟。
21. 细胞清洗:
a.加入至少3ml Perm/Wash Buffer I。
b.600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。c.振荡器低速振荡混匀细胞。
22.加入约500 μL的Perm/Wash Buffer I重悬细胞,混匀后上机检测。
Protocol II and III (Mild or Harsh Alcohol Method)
**根据所用的表面标记抗体和特异性磷酸化蛋白抗体选择使用Perm Buffer II或者Perm Buffer III 。更多信息请详见如下链接:Tested Surface Markers及BD FACSelect™ Buffer Compatibility Resource .
所需试剂:
试剂准备:
按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer (货号:558049)。使用前37°C 预热15-30分钟。
Perm Buffer II(货号:558052)或 III(558050)用前需置于-20°C-4°C预冷。
操作步骤:
1.取小鼠组织样本(如脾脏,胸腺,骨髓等),用PBS或完全培养基制成单细胞悬液
2. 350g 离心6- 8 分钟,弃上清
3.混匀细胞(此步动作需要轻柔)
4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. (选做步骤)因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激,所以有些细胞需要在前处理完成后,在完全培养基中静息2-4小时,以保证细胞恢复到未受刺激状态(参见操作说明)。
6. 用适当的刺激剂处理细胞,37°C 孵育适当的时间(1到30分钟,参见操作说明)。实验需设立未处理样本为阴性对照。
7.刺激处理完毕后,迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11.细胞清洗:
a.加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer(货号:554656)。
b.600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
c.振荡器低速振荡。
12.(选做步骤):为保证实验结果,若以上步骤红细胞裂解不充分,继续用溶血剂裂解细胞,但此步骤不得超过2次。
13.于1–10 x 10^6细胞中加入1ml (最少1ml)预冷的Perm Buffer II或 II进行细胞破膜。振荡器低速振荡,冰浴30分钟。
14. 清洗细胞:
a. 加入至少3ml Stain Buffer重悬细胞(对应每1ml Perm Buffer)。
b. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡混匀细胞。
15. 重复清洗细胞2次:
a. 加入与步骤9中相等量的Stain Buffer。
b. 600g 离心6-8分钟,弃上清,试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡混匀细胞。
d.重复步骤a-c。
16. 将细胞重悬于Stain Buffer,使细胞终浓度为5–10 x 10^6 cells/mL。