免疫组化非特异性染色消除方法

免疫组化非特异性染色消除方法

一、非特异性染色的主要因素

组织的非特异性染色的机理很简单，其产生的缘由主要可分为以

下几点：

（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而

不能被透析除去。

（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与

组织成分结合。

（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。

（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往

混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致简单混淆。

（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分

子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

（6）荧光素不纯，标本固定不当等。

二、消退非特异性染色的方法

消退荧光抗体非特异性染色的方法应依据产生的缘由实行适当的

方法，常用的方法有以下几种：

（一）动物脏器粉末汲取法

常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡

胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50~100mg，在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心

（3000~15000r/min）30min，1~2次后，即可使用其上清液。汲取

一般应在临用前进行，汲取后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。

染色应作汲取前后之比较，汲取时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000~15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进

行汲取，以免消耗过多的抗体。

肝粉或新奇细胞汲取是一种非特异性的消退方法，对荧光抗体的

荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可

用相同的组织干粉或匀浆沉淀物汲取之。

用脏器肝粉汲取对荧光抗体损失较多，假如依据Hiramotos氏等

的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2~3次，

12000r/min。

10min离心沉淀，用其沉淀物汲取其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样汲取对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，汲取后放置一周左右，用时有必要再汲取一次。

肝粉的制法：

（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水

洗2~3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。

（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水

少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。

（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2~3倍量生

理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用

2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。

（4）最终用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将

沉淀物平铺在干净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。

（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，

低温干燥保存。

（二）透析法

荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，

可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。

（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面

稍留空隙，紧扎。

（2）浸入0.02mol/pH。

7.1~7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50~100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3~4次PBS，约5~7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照耀下）。

（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法

除游离荧光素可用246cm柱层析法，具体方法参阅其次章。加入

荧光抗体15~18ml（按床体积的5%~10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30~40min ，

使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开头滴入洗脱液。加入洗脱液肯定量后，荧光抗体即向下移行，渐渐与存留于上端的

游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二

者分别距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水

杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），连续洗脱，游离荧光素则相继被

洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。

若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过

柱前透析一夜，否则，太浓NH4+，在蛋白未完全洗脱时即消失NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液消失蛋白时，即进行收集，之后消失SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最终是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可

再用。

如仅用小量荧光抗体，可用120cm的柱层析柱，取2g Sephadex

G-50装柱，即可过滤2~3.5ml荧光抗体。

（四）DEAE纤维素柱层析法

标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯

IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20~50mg标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：

（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（依据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，

分别洗脱和收集：

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）洗脱部分1。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）洗脱部分2。

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）洗脱部分3。

将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。

（2）柱上吸附的过度标记蛋白可连续增加NaCl的浓度至

2.0mol/L洗脱完。