免疫组化染色

免疫组化染色

一、固定

在12孔板中先用PBS洗两遍，把培养液洗掉，然后加入4%的多聚甲醛（PFA）10min（室温），再用PBS洗3次，每次间隔5 min。

二、破膜

将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.05% Triton PBS 破膜2 min（室温条件下），PBS洗3次，每次间隔5 min。

注释：第一步和第二步可以合并，具体操作如下

固定和破膜

1、在12孔板中加入4%的多聚甲醛（PFA），轻柔摇匀使其铺满孔板后将玻片加到孔板中，37℃，20~30 min。

2、将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.1 % Triton PBS （浓度最高不超过0.3 %）破膜2 min，PBS洗3次，每次间隔5 min（清洗时应该沿孔壁清洗不要接触玻片，否则其表面的细胞会被清洗掉）。

三、封闭

用二抗来源的10% 的血清封闭，室温封闭1 h。

封闭缓冲液（20mL）

10 % NGS （山羊血清Normal Goat Serum）

0.05 % Tween 20 （10 % Tween 20 100uL）

1×PBS 加至20mL

注释：如果时间来不及可放置在4°中过夜。

四、一抗

用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。4℃过夜，每个玻片150ul。PBS洗6次，每次间隔5 min。

或者

用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。将封闭缓冲液吸掉，加入PBS，轻柔摇匀使其铺满孔板。

将一抗先滴加在封口膜上，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在一抗上，室温放置2~3 h。

五、二抗

用1:500 （PBS），每个玻片150ul，避光1 h。PBS洗6次，每次间隔5 min。

加二抗的方法同上

六、封片

10ul 封片液先滴在载玻片上，尽量不要产生气泡，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在封片剂上，注意封片剂容易凝固。室温避光放置过夜。用指甲油将玻片周围封闭，4°放置即可。

注释：

1. 封闭缓冲液的配制（20mL）

10 % NGS （山羊血清Normal Goat Serum）

0.05 % Tween 20 （10 % Tween 20 100uL）

1×PBS 加至20mL

2.1 血清在封闭过程中的作用

封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。并非所有的免疫组化都由山羊血清封闭，因为一般二抗是羊抗X，所以采用山羊血清，其与使用二抗来源有关。非特异性位点即组织中某些可吸附一抗的非目的抗原蛋白，若不封闭，加入的一抗可能与此种位点结合，从而导致非特异性染色。那么加入了血清后，这部分被吸附的抗体被血清中的蛋白所替代，所以封闭后加入一抗，可保证一抗与目的蛋白相结合从而减低背景。大量蛋白堆积可能对目的抗原有影响，但是加入一抗后，一抗对抗原的竞争结合力大于血清蛋白堆积力从而抵消这种影响。

2.2非特异性染色的常见原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分。非特异性染色的常见原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分，有效的消除方法就是用二抗来源的动物血清封闭，也可用1%BSA替代。首选二抗来源的动物血清封闭，能更好的保证二抗特异性结合一抗，不会出现二抗与标本的非特异性结合。至于一抗的特异性，只能看一抗抗体与标本的特异性结合度，封闭主要是针对二抗，保证其与一抗特异结合，才能保证荧光染色。如果一抗与标本的特异性结合度不高，即便保证了二抗与一抗特异结合，染色结果仍能看到非特异性染色。二抗来源的动物血清封闭的是组织上带电荷基团，亲和力远远高于因电荷作用的结合，因此会竞争胜出。

3. Tween-20的作用

Tween-20是一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做westen blot时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如SDS则破坏蛋白的结构。

4. 关于一抗加叠氮化钠的问题

叠氮钠是防腐剂，能抑制过氧化物酶的活性。比较好的办法就是在一抗的原液中加叠氮钠，这样在使用时还需要一个稀释的过程，稀释了以后叠氮钠对HRP酶（辣根过氧化物酶）活性的影响就可以忽略不计了，一抗的稀释度越大，叠氮钠的影响就越小。或者用柳硫汞替代叠氮钠，就不存在对HRP酶活性影响的问题了。