组培培养基本操作步骤

实验仪器设备和试剂 冰箱，天平，酸度计，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，
100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(500ml，1000ml)， 药勺、称量纸、滴管、玻璃棒， 电炉，微波炉 NH4NO3, MnSO4.4H2O, KNO3, ZnSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, Na2MoO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KH2PO4, CoCl2.6H2O, H2BO3，Na2?EDTA?2H2O，KI, FeSO4.7H2O，烟酸， 甘氨 酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水
大量元素
20
25
微量元素
有机成分
铁盐
2，4-D
②取50ml 烧杯一个，用25ml 量筒取大量元素母液25ml，然后用各母液专用 移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和2，4-D 母液，置于烧杯 中备用。 ③取500ml 烧杯一个，加入300ml 蒸馏水，称量琼脂3.5g 倒入烧杯中，将烧杯 置于电炉上或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化后，加入10g 蔗糖，充分溶解后， 将准备好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素母液混合液倒入烧杯中， 用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入500ml 烧杯中，并加蒸馏水 定容。 ④充分混合后，用1mol/LNaOH 和1mol/LHCl 调节培养基的 pH 为5.8。 ⑤把培养基分装到广口瓶中，每瓶约50ml。用封口膜封好瓶口。贴上标签，注 明培养基名称，配制者姓名和配制日期，待灭菌。 ⑵培养基灭菌 ①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅 的消毒桶内。盖上锅盖，上好螺栓后接通电源加热。 ②排放冷空气，关闭放气阀，当灭菌锅盖上的压力表指针移至0.1Mpa(121℃)， 控制电源，使压力表稳定在该压力下15分钟，即达到灭菌目的。 ③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针 降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。
Na·MoO4?2H 2O
CuSO4?5H2 O
100
CoCl2?6H2O
100
贮备液Ⅲ
100
FeSO4?7H2
O
400
Na2?EDTA?2
H2O
20000
数量(mg/L)
166 1240 4460 1720 50 5 5
5560 7460
实验二、培养基的配制与灭菌
实验目的 学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。
实验方法 ⑴MS 大量元素母液的配制
配制时先用量筒量取蒸馏水大约800ml，放入1000ml 的烧杯中，按照配方表中 用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O， 待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将
溶液倒入1000ml 的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，然后，倒入细口试剂瓶 中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备 用。 ⑵MS 微量元素母液的配制 按照配方表中用量用电子天平分别依次称取 MnSO4 ?4H2O， ZnSO4?7H2O ， H2BO3 ，KI ，NaMoO4?2H2O， CuSO4?5H2O， CoCl2?6H2O，用蒸馏水 逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容，装入500ml 细口试剂瓶中，贴上标签， 注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 ⑶MS 铁盐母液配制 把 FeSO4?7H2O 和 Na2?EDTA?2H2O 分别置于200ml 蒸馏水中，加热并不断 搅拌使之溶解，然后将2种溶液混合，把 pH 值调到5.5，加蒸馏水到最终容积 500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1－2min，在室温下避光保存一段时间令 其充分反应后，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰 箱中保存备用。 ⑷MS 有机化合物母液的配制 按配方表中用量依次称取：维生素 B1，烟酸，甘氨酸，维生素 B6，用蒸馏水依 次溶解并定容后，装入500ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日 期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 ⑸植物生长物质母液的配制 2，4-D 母液：准确称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定 容至100ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、 配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
④刚灭过菌的培养基应在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养 基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。
要求：每人准备培养基2瓶。 提前准备实验三所需的无菌材料。 稀酸和稀碱的配制方法 1mol/LHCl 取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。 1mol/LNaOH 称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。
实验四、愈伤组织的器官分化
目的 通过实验，掌握运用植物生长调节物质调控植物愈伤组织分化的方法。
原理 离体的植物组织在一定条件下，可发生“脱分化”，即已经分化了的植物细胞
重新分裂生长，形成均一的无组织结构的细胞团，即愈伤组织。这种愈伤组织在 一定条件下，又Baidu Nhomakorabea“再分化”出根和芽等器官。在该过程中，植物生长调节物质起 着决定作用，调控着愈伤组织的芽或根的分化。
MS 培养基母液配方
成分 贮备液Ⅰ NH4NO3 KNO3 CaCL2 ?
2H2O MgSO4?7H2
O KH2PO4
贮备液Ⅳ
烟酸 维生素 B6 维生素 B1
甘氨酸
肌醇
数量(mg/L)
成分 贮备液Ⅱ
33000
KI
38000
H2BO3
8800
MnSO4 ?4H2 O
7400
ZnSO4?7H2 O
3400
实验步骤 ⑴培养基的配制
每组配制培养基500ml，培养基组成为：MS+0.05mg/L 2,4-D+2%蔗糖+0.7%琼 脂(pH5.8) ①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。 本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液的用量如表1所示：
母液名称
母液浓度
扩大倍数
500 培 养 基 吸 取量
原理 组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是
微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺 利进行。
实验仪器设备和试剂 天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，
移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，酸 度计或试纸，培养瓶，封口膜，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，滴瓶 琼脂，蔗糖，蒸馏水，2，4-D，1mol/LHCl，1mol/LNaOH
胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的 消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养 成功的前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上， 通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 三、材料、试剂和器具 材料：直根胡萝卜
培养基：MS+0.05mg/L 2,4-D 器具： 无菌器材： 20张吸水纸 2个不锈钢托碟，2套直径90mm 的培养皿 1升无菌水 大号、中号、小号镊子各2把 2把解剖刀 1个打孔器 2个500ml 烧杯 非无菌材料： 大约20%（体积比）浓度的次氯酸钠的消毒液1L 玻璃烧杯（1000ml）或搪瓷缸(装废液用) 1个500ml 消毒缸 1台酒精灯及火机 1个锥形瓶（150ml），内装95%酒精100ml 1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球 橡皮筋若干 标签纸、记号笔、1把大号镊子 四、实验步骤
实验报告：接种2-6天后观察污染情况，计算污染率。每周观察并记录胡萝 卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物形态的变化，愈伤组 织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），计算愈伤 组织诱导率。 污染率=污染的材料数/总接种材料数×100% 诱导率=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%
植物组织培养实习
实习目的意义 营养繁殖可获得在遗传上与其亲本植株完全相同的后代，从而使品种的特性
代代相传。植物组织培养作为植物营养繁殖的一个新手段，与常规方法相比其最 显著的优点是：可以用较短的时间和较少的空间，由一个个体开始产生大量的植 株。植物组织培养既是一门科学，又是一门技术。作为科学，它以植物学、植物 生理学、遗传学为理论基础，研究植物在离体条件下的建成、营养生理、体细胞 遗传等规律。作为一门技术，它既是植物细胞工程和基因工程的技术基础，又是 植物快速无性繁殖的重要技术。 影响组织培养的因素很多，既有内因，也有外因。就内因来说，主要是植物自身 生长、发育与繁殖的特点。一般植物都具有扦插生根、根蘖出芽等营养繁殖的能 力，但不同植物的难易程度不同，对环境条件的要求也不同。对于能否生根、生
分化培养基和根分化培养基中，并置于26℃、在2000lx、每天14h 光照下培养， 并逐日观察记录胡萝卜块根愈伤组织的形态变化，并在3-4周后统计愈伤组织的 幼芽或幼根的分化率。
实验报告 观察并记录胡萝卜块根愈伤组织在根分化培养基上培养10-15天后的不定根
发生情况，并计算生根率；观察并记录胡萝卜块根愈伤组织在芽分化培养基上培 养3-4周后的生长和幼芽分化状况，并计算愈伤组织的幼芽分化率。 生根率=生根愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数×100% 幼芽分化率=生芽愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数×100%
实验一、贮备液的配制和保存
实验目的 通过配制 MS 培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。
原理 配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将
所选取培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一 系列的母液置于冰箱中保存 ，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以 MS 培养基为例，所需配制的母液可分为：MS 大量元素母液、MS 微量元素母液、 MS 铁盐母液和 MS 有机化合物母液等。另外，还要配制生长物质母液，在不同 类型的培养基中使用。
实验材料、试剂和器具 材料：实验3获得的胡萝卜块根愈伤组织
试剂：NAA、6-BA、琼脂、蔗糖 器具： 无菌：镊子、解剖刀、无菌纸、无菌培养皿 非无菌：超净工作台、酒精灯
实验步骤 ⑴愈伤组织芽或根分化培养基的配制
首先按实验2的方法，制备下列供胡萝卜块根愈伤组织芽分化的培养基： MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L，MS+6-BA1.0mg/L；胡萝卜愈伤组织根分化培 养基：MS+NAA0.5mg/L。 ⑵转接 在超净工作台上，将实验3所获得的胡萝卜块根愈伤组织，分别转入愈伤组织芽
实验三、植物组织无菌培养的一般步骤---胡萝卜愈伤组织的诱导 一、实验目的 培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个很重要的环节。通过以胡萝卜根组 织为外植体进行组培，领会无菌培养对试验材料消毒、接种的要求，初步掌握植 物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织诱导的方法。
实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织，甚至是细
接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工 作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30，然后关闭紫外灯， 通风20后，打开日光灯即可进行无菌操作。
先将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，切成大约100mm 长的片段放进500ml 有盖消毒缸中，倒入次氯酸钠的消毒液将植物材料淹没浸泡约30分钟。 灭菌过程中在每个培养瓶上标记培养基名称、培养日期。 把灭了菌的胡萝卜转移到无菌室。用无菌水将胡萝卜洗3次，每次2分钟，洗时不 断摇动烧杯以确保完全除去次氯酸钠，并用吸水纸吸干。 取1条胡萝卜，在无菌托碟上从两端各切去20mm，用解剖刀将余下的根切成一系 列5mm 厚的横切片，将每一切片转移到无菌培养皿中，通过形成层用打孔器切 成小圆柱，这样每块外植体都包含韧皮部、形成层和木质部三部分。重复这一程 序直到为实验积累了足够数量的外植体。 取下培养瓶的封口膜，用火烧灼瓶口。用镊子转移5块外植体插入到琼脂上。注 意将近根尖的一面接触培养基。立即用封口膜封好瓶口。 在对植物材料进行消毒处理的同时，对所要使用的器械进行消毒，方法是把它们 浸入95%酒精中，取出后再置酒精灯火焰上灼烧，待冷却后即可使用。所有操作 器械往往需要在每次使用后消毒一次。 将培养瓶放到培养架上，在25℃下的黑暗中培养6－8周，获得充分生长的愈伤组 织。