第05章细胞培养dun
细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。
细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。
细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。
《细胞培养医学》课件
《细胞培养医学》课件xx年xx月xx日•细胞培养技术简介•细胞培养的基本原理•细胞培养的实验操作•细胞培养的医学应用目•细胞培养的注意事项与伦理要求•研究展望与未来发展录01细胞培养技术简介细胞培养技术是指将生物或组织的样本置于体外环境中，进行分离、培养、传代、鉴定和分析的一门技术。
细胞培养包括原代细胞培养和传代细胞培养两种类型，其中原代细胞培养主要用于科研和药物筛选，而传代细胞培养则应用于细胞系建立、细胞库建立等。
细胞培养技术的定义细胞培养技术的发展历程细胞培养技术最早可以追溯到19世纪末期，当时科学家们开始尝试在体外环境中培养动物细胞。
到了20世纪50年代，随着组织培养技术的不断发展和完善，细胞培养技术开始广泛应用于生物学、医学、农学等领域。
近年来，随着生物技术的不断发展，细胞培养技术也在不断改进和优化，例如3D细胞培养、微载体细胞培养等新技术的应用，使得细胞培养技术的效率和精度都得到了极大的提高。
细胞培养技术的应用范围细胞培养技术广泛应用于生物学、医学、农学等领域。
在医学领域中，细胞培养技术被广泛应用于药物筛选、疾病机制研究、疫苗研发等方面。
同时，细胞培养技术还在农业、环境保护等领域中得到了广泛的应用，例如用于转基因植物的培育和环境样品的检测等。
02细胞培养的基本原理细胞生命周期分为四个阶段，即G1期、S期、G2期和M期。
细胞周期的调控对于细胞的正常生长和分裂至关重要。
细胞周期细胞分裂是生物体生长和发育的基础，包括有丝分裂和减数分裂两种形式。
有丝分裂是细胞数目的增加，减数分裂是生殖细胞形成过程中染色体的分配。
细胞分裂细胞周期与细胞分裂细胞分化是指由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。
细胞分化是生物发育的基础，对于机体正常功能的维持至关重要。
细胞凋亡是指由基因控制的细胞自动结束生命的过程，又称为程序性死亡。
细胞凋亡是机体清除多余、异常细胞以及消除有害物质的重要机制。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
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倒 置 显 微 镜
back
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液 氮 罐
back
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细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
细胞培养技术3篇
细胞培养技术第一篇：细胞培养技术的基本概念细胞培养技术是指在体外人工培养生物细胞的一种技术，该技术主要应用于生命科学、医学研究、生物制药等领域。
细胞培养技术的基本概念主要包括：细胞培养的类型、培养基、细胞的消耗物质、细胞培养的设备和细胞培养的步骤等，下面就逐一进行介绍。
一、细胞培养的类型细胞培养主要分为原代细胞培养和继代细胞培养两种类型。
1.原代细胞培养原代细胞培养是指直接从体组织中分离出来的生物细胞进行培养。
该类型的细胞培养在实验室中很少用到，因为从体组织中分离细胞的方法很繁琐，而且这种方法得到的细胞数量和品质不能保证。
2.继代细胞培养继代细胞培养是指从已经培养的细胞中分离出来的细胞进行培养。
这种类型的细胞培养方法非常常见，因为可以在实验室中轻松实现。
二、培养基培养基是指用来提供细胞分裂和生长所需营养物质的一种物质。
培养基通常由肝素、胰岛素和细胞因子等多种不同的化合物构成，以满足不同类型的细胞对营养物质的需求。
三、细胞的消耗物质细胞培养期间需要提供物种很多，其中主要包括以下几种：1.抗生素：用来防止在培养细胞中出现感染。
2.气体：氧气和二氧化碳是保证细胞正常生长的重要物质。
3.酸碱指示剂：用来检测培养基的酸碱度，以保证细胞处于适宜的pH值下。
四、细胞培养设备1.培养箱：用于控制培养环境中的温度、湿度和氧气等因素。
2.显微镜：用来观察细胞的形态和生长情况。
若无显微镜，还需要检测仪器，用来检测培养细胞的生长情况。
3.细胞培养板：用来培养细胞和收集细胞。
五、细胞培养的步骤细胞培养的步骤一般可以分为以下几个：1.细胞分离：从样品中分离出单个的细胞。
2.细胞传代：选取健康的细胞将其转移至新的培养基中，继续增殖，以获得更多的细胞。
3.细胞计数：测量细胞数量以确定下一步操作所需的细胞量。
4.细胞培养：将细胞加入新的培养基中，进行培养。
根据细胞培养的不同类型，上述步骤会稍有不同。
总之，细胞培养技术对于生命科学、医学研究、生物制药等领域都具有重要的应用价值，它通过人工培养细胞，为科学家们提供了一种研究生物学的新途径。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤 Last revised by LE LE in 2021细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。
原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。
利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。
其操作步骤如下。
1.剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。
用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。
4.注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。
（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。
原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。
利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。
其操作步骤如下。
1.剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。
用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。
4.注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。
（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究和生产生物学领域的细胞。
细胞培养的操作步骤通常包括以下几个环节：准备培养基和试剂、细胞传代和细胞分离、细胞接种和培养条件的控制。
一、准备培养基和试剂1.确定所使用的培养基类型，如DMEM、RPMI-1640等，并根据实验的需求将其配制好。
2.购买所需的培养基添加剂，如胎牛血清（FBS）、生长因子、抗生素等，并根据实验要求将其加入到培养基中。
3.清洁工作台，并将所需的器具和试剂取出，进行消毒处理。
二、细胞传代和细胞分离4.将细胞传代物接种到一个新的培养器中。
根据实验的要求，可以使用细胞培养瓶或细胞培养皿等容器。
5.静置一段时间，让细胞附着在底部表面上，并增加培养基的吸附。
6.将旧的培养基小心地倒掉，并用含有酶的溶液，如胰酶-EDTA或胰蛋白酶，洗涤细胞。
此步骤旨在除去细胞表面的蛋白质和粘附物，使细胞能够自由分离。
7.加入一定量的培养基，将细胞解离，并通过轻轻摇动容器促进细胞的分散。
8.将分散的细胞转移到新的培养器中，并加入适量的培养基使其恢复生长。
三、细胞接种9.将细胞培养器中的细胞进行视觉检查，确保它们的形态和数量适合接种。
10.使用显微镜检查细胞的活力、纯度和质量。
如果细胞质量不佳，应根据需要调整细胞密度或传代更多次。
11.根据实验要求，将细胞重新分散并计算细胞密度。
12.准备接种物：使用无菌技术，将细胞和培养基混合，并在接种器中将混合物分散均匀。
13.将接种物小心地滴入新的培养器中，确保细胞均匀分布。
14.检查细胞的附着情况并加入适量的培养基。
四、培养条件的控制15.放置培养器在恒温培养箱中，保持适当的温度（通常在37摄氏度）、湿度和二氧化碳浓度（通常是5%）。
16.定期检查细胞的生长状况，观察细胞的形态和数量，以确定培养基是否需要更换或细胞是否需要传代。
17.如果需要传代，在细胞接种后一段时间内，观察细胞的生长速率和密度，根据需要调整传代时间和细胞密度。
《细胞培养培训》课件
为了获得更多的细胞，可以在传代后进行扩增培 养，使细胞数量增加。
实验结束后的处理
清洗与整理
实验结束后，对实验室进行清洗和整理，确保实验室的清洁和整 洁。
数据整理与分析
对实验数据进行整理和分析，得出结论并撰写实验报告。
废弃物处理
按照实验室规定对废弃物进行处理，确保实验室的安全和环保。
05
细胞培养的注意事项与安 全防护
洁度和无菌条件等。
细胞接种与培养
细胞计数与稀释
根据实验需求，对细胞进行计数 并稀释到适当的密度。
接种细胞
将稀释后的细胞接种到细胞培养皿 或培养瓶中，确保细胞贴壁良好。
培养条件
将接种后的细胞放置在适宜的温度 、湿度、CO2浓度和培养基中，并 定期进行观察和记录。
细胞观察与检测
形态观察
定期观察细胞的形态变化，包括 生长状态、贴壁情况、分裂情况
总结词
通过分裂和增殖来维持的细胞培养。
详细描述
传代细胞培养是通过细胞的分裂和增殖来维持的，这些细胞在培养过程中会逐渐 适应环境并失去其原始特性。传代细胞培养广泛应用于实验室研究，用于生产疫 苗、抗体和药物筛选等。
干细胞培养
总结词
用于培养干细胞的细胞培养技术。
详细描述
干细胞培养是指用于培养干细胞的细胞培养技术，干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可以分化 成不同类型的细胞。干细胞培养在再生医学、药物筛选和疾病模型建立等方面具有广泛的应用前景。
VS
详细描述
癌细胞传代培养是研究癌细胞生长、增殖 、侵袭和转移等特性的重要手段，通过传 代培养可以获得大量癌细胞用于药物筛选 、基因组学和蛋白质组学等方面的研究。
案例三：癌细胞的传代培养与观察
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是杂交瘤制备单克隆抗体过程中必不可少的实验操作，细胞培养是一个困难重重的事情，多少英雄都在细胞培养上自挂东南枝，本文就细胞培养的步骤及注意事项做一描述。
步骤一、复苏1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5. 3天换一次培养基。
二、传代1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2. 把原有培养基吸掉。
3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。
继续培养。
三、冻存把细胞消化下来并离心（同上）。
用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制： 70%的完全培养基+20�S+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
注意事项严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。
不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。
有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。
细胞培养方法
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
第05章细胞培养dun
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
(4)于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长，若需培养 更长时间可补加0.8mL/孔含琼脂的培养液，待有 明显集落形成为止。 (5)集落（克隆）计数：在倒置显微镜下观察并计数 直径大于75μm或含有50个细胞以上的克隆。
5.4 细胞的克隆化
①细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体 中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新 的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落） 称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。 ②细胞株中每个细胞的遗传特征和生物学特性极为相似和一 致，利于对不同群体细胞的形态和功能进行比较和研究。 若该细胞株只是一般传代、无一系列实验鉴定指标，则为 一般细胞株。 若有一系列实验指标报道的，则称为限定性细胞株，如由 幼地鼠肾细胞系（BHK21）第13孔的单个细胞形成的细 胞株称BHK-21C-13（代表克隆13），其形态规则，特性 稳定，便于研究。
（2）人工纯化
利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件， 抑制其他细胞的生长从而纯化细胞。
①细胞因子依赖纯化法指人和动物组织中某些细胞需 要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和 生长繁殖，如：IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子， BCGF是B细胞的生长因子。 ②酶消化法是比较常用的纯化方法，对于贴壁细胞， 能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性 不同，使两者分开，达到纯化的目的。 酶消化法对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离 纯化也是十分有效的。
细胞培养全过程
我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。
细胞培养室实验操作规范一、细胞培养室的环境1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件：1) 培养室应为独立、封闭的空间。
培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入；2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上；3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒；4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。
5) 定期清理冰箱。
将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除；6) 培养箱要定期清洁。
隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份；7) 注意监测CO2的气压，及时补充。
8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。
2. 实验器具的清洗、消毒灭菌：1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。
*洗液：浓硫酸+重铬酸钾2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。
4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。
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第05章细胞培养dun
①静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞)的培养的起
No 始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的
细胞发生脱落，漂浮。 ②若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是
又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的 机械损伤；
Image (4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和 繁殖，如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到 培养瓶，尽量减少细胞损失； (5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小
牛血清浓度可适当加大。
第05章细胞培养dun
第05章细胞培养dun
➢ 原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不 同细胞采取不同的方法进行传代。
No ✓ 贴壁生长的细胞用消化法传代，
✓ 部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。 ✓ 悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行
传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传 代。
第05章细胞培养dun
（2）人工纯化
➢ 利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件， 抑制其他细胞的生长从而纯化细胞。
No ①细胞因子依赖纯化法指人和动物组织中某些细胞需 要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和 生长繁殖，如：IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子， BCGF是B细胞的生长因子。
No 细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细
胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂。
➢ 鉴于粘附细胞贴壁不牢固，可用酶消化法使粘ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ细
Image 胞脱壁分离，以达到骨髓基质细胞或血液中肌样细
胞与淋巴细胞分开和纯化的目的。
第05章细胞培养dun
③机械刮除法指在原代培养时，如果上皮细胞和成 纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小
Image ②酶消化法是比较常用的纯化方法，对于贴壁细胞， 能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性 不同，使两者分开，达到纯化的目的。
✓ 酶消化法对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离 纯化也是十分有效的。
第05章细胞培养dun
例：骨髓基质肌样细胞的纯化 ➢ 在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样
No 片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机
No 密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被
细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分 瓶培养，即传代。 ➢ 每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10 代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20
Image 代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代
细胞系）。 ✓ 传代细胞系的建立的关键是初代培养的首次传代。
第五章 细胞培养
No 5.1 原代细胞的培养与维持
5.2 原代细胞培养的传代
Image 5.3 细胞的纯化
5.4 细胞的克隆化 5.5 细胞的形态观察
第05章细胞培养dun
• 细胞培养技术也叫细胞克隆技术。不论对于整个 生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来
No 说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培
5.3 细胞的纯化 ➢ 一般分为两种：自然纯化和人工纯化。
No （1）自然纯化
➢ 利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程 中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞， 靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞， 达到细胞纯化的目的。
Image ➢ 这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选 择细胞，花费时间长，留下来的往往是成纤维细 胞。恶性变异的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过 此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。
Image 用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓
度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效 价提高和测定结果（如空斑）更加明显、 准确。
第05章细胞培养dun
③待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时
No 的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，
即倒去旧液，换入与原培养液相同的等量新 鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和 陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营
Image 养。
④若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但 不需增殖，此时要换成含血清低的维持液。
第05章细胞培养dun
⑤悬浮细胞：凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴 结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细
No 胞等悬浮细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。
➢ 待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变 酸，说明细胞生长繁殖良好。
Image ➢ 随后细胞系的维持是通过换液传代再换液、再传 代和细胞种子冻存来实现的。
第05章细胞培养dun
传代时注意事项：
(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急 于传代；
No (2)原代培养的贴壁细胞多混杂细胞，形态各异，用胰蛋白酶 消化时要掌握好消化时间； (3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，
➢ 一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞 不丢失）。
Image ➢ 待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变 化时，此时可考虑传代。传代一定要待细胞密度 较高时才能进行，以防传代失败。
第05章细胞培养dun
5.2 原代细胞培养的传代（Subculture） ➢ 原代培养后由于细胞增殖，数量增加甚至达饱和
养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包 括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个 细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化 的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且
Image 细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得
到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是 从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技 术中最核心、最基础的技术。
第05章细胞培养dun
➢ 消化初代培养法 如左图。
➢ 对于悬浮生长的
NoNo 细胞，如白血病 细胞、淋巴细胞、 骨髓细胞、胸水 和腹水中的癌细
ImImageage胞和免疫细胞无 需消化，可采用 低速离心分离， 直接培养，或经 淋巴细胞分层液 分离后接种培养。
第05章细胞培养dun
5.1 原代细胞的培养与维持