第05章细胞培养dun
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
➢ 一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞 不丢失）。
Image ➢ 待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变 化时，此时可考虑传代。传代一定要待细胞密度 较高时才能进行，以防传代失败。
第05章细胞培养dun
5.2 原代细胞培养的传代（Subculture） ➢ 原代培养后由于细胞增殖，数量增加甚至达饱和
第五章 细胞培养
No 5.1 原代细胞的培养与维持
5.2 原代细胞培养的传代
Image 5.3 细胞的纯化
5.4 细胞的克隆化 5.5 细胞的形态观察
第05章细胞培养dun
• 细胞培养技术也叫细胞克隆技术。不论对于整个 生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来
No 说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培
第05章细胞培养dun
➢ 原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不 同细胞采取不同的方法进行传代。
No ✓ 贴壁生长的细胞用消化法传代，
✓ 部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。 ✓ 悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行
传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传 代。
第05章细胞培养dun
（2）人工纯化
➢ 利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件， 抑制其他细胞的生长从而纯化细胞。
No ①细胞因子依赖纯化法指人和动物组织中某些细胞需 要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和 生长繁殖，如：IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子， BCGF是B细胞的生长因子。
No 原代细胞（primary culture cell）是指从机体取 出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代 细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培 养。 Image
第05章细胞百度文库养dun
①静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞)的培养的起
No 始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的
细胞发生脱落，漂浮。 ②若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是
养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包 括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个 细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化 的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且
Image 细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得
到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是 从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技 术中最核心、最基础的技术。
5.3 细胞的纯化 ➢ 一般分为两种：自然纯化和人工纯化。
No （1）自然纯化
➢ 利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程 中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞， 靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞， 达到细胞纯化的目的。
Image ➢ 这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选 择细胞，花费时间长，留下来的往往是成纤维细 胞。恶性变异的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过 此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。
No 细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细
胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂。
➢ 鉴于粘附细胞贴壁不牢固，可用酶消化法使粘附细
Image 胞脱壁分离，以达到骨髓基质细胞或血液中肌样细
胞与淋巴细胞分开和纯化的目的。
第05章细胞培养dun
③机械刮除法指在原代培养时，如果上皮细胞和成 纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小
Image ➢ 随后细胞系的维持是通过换液传代再换液、再传 代和细胞种子冻存来实现的。
第05章细胞培养dun
传代时注意事项：
(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急 于传代；
No (2)原代培养的贴壁细胞多混杂细胞，形态各异，用胰蛋白酶 消化时要掌握好消化时间； (3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，
Image ②酶消化法是比较常用的纯化方法，对于贴壁细胞， 能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性 不同，使两者分开，达到纯化的目的。
✓ 酶消化法对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离 纯化也是十分有效的。
第05章细胞培养dun
例：骨髓基质肌样细胞的纯化 ➢ 在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样
Image 用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓
度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效 价提高和测定结果（如空斑）更加明显、 准确。
第05章细胞培养dun
③待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时
No 的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，
即倒去旧液，换入与原培养液相同的等量新 鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和 陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营
第05章细胞培养dun
➢ 消化初代培养法 如左图。
➢ 对于悬浮生长的
NoNo 细胞，如白血病 细胞、淋巴细胞、 骨髓细胞、胸水 和腹水中的癌细
ImImageage胞和免疫细胞无 需消化，可采用 低速离心分离， 直接培养，或经 淋巴细胞分层液 分离后接种培养。
第05章细胞培养dun
5.1 原代细胞的培养与维持
Image 养。
④若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但 不需增殖，此时要换成含血清低的维持液。
第05章细胞培养dun
⑤悬浮细胞：凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴 结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细
No 胞等悬浮细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。
➢ 待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变 酸，说明细胞生长繁殖良好。
No 片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机
No 密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被
细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分 瓶培养，即传代。 ➢ 每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10 代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20
Image 代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代
细胞系）。 ✓ 传代细胞系的建立的关键是初代培养的首次传代。
又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的 机械损伤；
Image (4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和 繁殖，如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到 培养瓶，尽量减少细胞损失； (5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小
牛血清浓度可适当加大。
第05章细胞培养dun
Image ➢ 待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变 化时，此时可考虑传代。传代一定要待细胞密度 较高时才能进行，以防传代失败。
第05章细胞培养dun
5.2 原代细胞培养的传代（Subculture） ➢ 原代培养后由于细胞增殖，数量增加甚至达饱和
第五章 细胞培养
No 5.1 原代细胞的培养与维持
5.2 原代细胞培养的传代
Image 5.3 细胞的纯化
5.4 细胞的克隆化 5.5 细胞的形态观察
第05章细胞培养dun
• 细胞培养技术也叫细胞克隆技术。不论对于整个 生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来
No 说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培
第05章细胞培养dun
➢ 原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不 同细胞采取不同的方法进行传代。
No ✓ 贴壁生长的细胞用消化法传代，
✓ 部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。 ✓ 悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行
传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传 代。
第05章细胞培养dun
（2）人工纯化
➢ 利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件， 抑制其他细胞的生长从而纯化细胞。
No ①细胞因子依赖纯化法指人和动物组织中某些细胞需 要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和 生长繁殖，如：IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子， BCGF是B细胞的生长因子。
No 原代细胞（primary culture cell）是指从机体取 出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代 细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培 养。 Image
第05章细胞百度文库养dun
①静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞)的培养的起
No 始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的
细胞发生脱落，漂浮。 ②若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是
养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包 括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个 细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化 的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且
Image 细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得
到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是 从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技 术中最核心、最基础的技术。
5.3 细胞的纯化 ➢ 一般分为两种：自然纯化和人工纯化。
No （1）自然纯化
➢ 利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程 中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞， 靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞， 达到细胞纯化的目的。
Image ➢ 这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选 择细胞，花费时间长，留下来的往往是成纤维细 胞。恶性变异的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过 此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。
No 细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细
胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂。
➢ 鉴于粘附细胞贴壁不牢固，可用酶消化法使粘附细
Image 胞脱壁分离，以达到骨髓基质细胞或血液中肌样细
胞与淋巴细胞分开和纯化的目的。
第05章细胞培养dun
③机械刮除法指在原代培养时，如果上皮细胞和成 纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小
Image ➢ 随后细胞系的维持是通过换液传代再换液、再传 代和细胞种子冻存来实现的。
第05章细胞培养dun
传代时注意事项：
(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急 于传代；
No (2)原代培养的贴壁细胞多混杂细胞，形态各异，用胰蛋白酶 消化时要掌握好消化时间； (3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，
Image ②酶消化法是比较常用的纯化方法，对于贴壁细胞， 能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性 不同，使两者分开，达到纯化的目的。
✓ 酶消化法对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离 纯化也是十分有效的。
第05章细胞培养dun
例：骨髓基质肌样细胞的纯化 ➢ 在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样
Image 用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓
度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效 价提高和测定结果（如空斑）更加明显、 准确。
第05章细胞培养dun
③待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时
No 的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，
即倒去旧液，换入与原培养液相同的等量新 鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和 陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营
第05章细胞培养dun
➢ 消化初代培养法 如左图。
➢ 对于悬浮生长的
NoNo 细胞，如白血病 细胞、淋巴细胞、 骨髓细胞、胸水 和腹水中的癌细
ImImageage胞和免疫细胞无 需消化，可采用 低速离心分离， 直接培养，或经 淋巴细胞分层液 分离后接种培养。
第05章细胞培养dun
5.1 原代细胞的培养与维持
Image 养。
④若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但 不需增殖，此时要换成含血清低的维持液。
第05章细胞培养dun
⑤悬浮细胞：凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴 结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细
No 胞等悬浮细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。
➢ 待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变 酸，说明细胞生长繁殖良好。
No 片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机
No 密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被
细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分 瓶培养，即传代。 ➢ 每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10 代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20
Image 代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代
细胞系）。 ✓ 传代细胞系的建立的关键是初代培养的首次传代。
又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的 机械损伤；
Image (4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和 繁殖，如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到 培养瓶，尽量减少细胞损失； (5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小
牛血清浓度可适当加大。
第05章细胞培养dun