基因操作总结

质粒重组的注意事项

1质粒重组主要包括质粒提取、限制性酶切、目的片段回收、连接及连接产物的转化这五个基本步骤。现在结合本人在实验室长期从事质粒重组的实际情况总结一下质粒重组实验操作的一些注意事项。

1.1 质粒提取：质粒重组对质粒的质量要求比较高；我们实验室是用碱裂解法提取质粒，一般说来，如果质粒的拷贝数比较高而小量制备的质粒量可以满足实验需要的话，那么对于初学者本人不推荐在质粒提取这一步使用大量制备方法，因为大量制备方法步骤过多对质粒的“伤害”要大于小量提取方法且所需时间相对较长。小量提取质粒过程中建议只用酚－氯仿抽提一次即可，上清少取一些（200ul一般）就不需要用氯仿再抽提一次了，最后在用TER 溶解质粒之前质粒的晾干最好是放在37度培养箱内，若质粒提取起始菌液为1.5ml则晾干时间最好不要超过10分钟（一般5分钟即可）；若质粒提取起始菌液为3ml则晾干时间最好不要超过20分钟，质粒晾干后马上加入TER 于60度水浴锅中助溶20分钟。

1.2 限制性酶切：一般我喜欢用总体积为80ul的酶切体系，加入的酶量为1ul（10个单位）。对于将来要做为载体的DNA模板一般切割量是2－3ug；而对于做为外插片段的质粒则要考虑酶切下来的小片段与质粒的长度比例来确定模板量，比如我们要从10Kb的质粒上切下的外插片段长度为1Kb，那么我们的小片段与质粒的质量比为1：10，这样的话我们为了保证小片段有800ng－1ug而需要酶切的模板量则是8ug－10ug。

1.3 目的片段回收：酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯照射下切取所要的目的条带时，一定要谨记两个要求：1、一定要快；2、胶块一定要小。

1.4 连接：载体一般加50－100ng左右，外插片段加的量是保证与载体的mol比为3：1即可。本人做连接反应从来不做梯度，因为我坚信如果回收的目的片段质量好的话，一个反应即可成功。

1.5 连接产物的转化：将连接产物转入大肠杆菌常用的方法有电转化法和热激法。电转化法依靠短暂的高压电脉冲造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔有利于DNA进入细菌；电转化法转化大肠杆菌时,电压高,脉冲时间长，转化率高，但细胞的死亡率也高且需要购买电转化仪。热激法转化大肠杆菌不需要电转化仪，操作简便，是我们实验室所选用的转化方法。

热激法转化细菌成功的关键步骤是感受态细胞的制备，目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl

和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且2

其转化效率完全可以满足一般实验的要求。CaCl2法制备感受态细胞热激法转化细菌的

的原理是：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA

形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细

胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数十分钟后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转

化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

在转化过程中所要注意的事项有以下几点：

（1）感受态细胞的制备尽量在低温条件下操作,且动作要轻柔;

（2）感受态细胞制备好后加入连接产物轻柔混匀一次在冰上放置不要少于20分钟,而且

注意冰浴过程中不要再去混匀它们。

（3）热激后加入液体培养基复舒时摇床转速控制在200转/分以内。

（4）用涂布棒将转化产物涂平板时，注意用力要轻，快速涂匀即可。

（5）平板倒置在培养箱里培养时间一般为16-18小时，不要超过20小时。

2 实验举例：

2.1pCAMBIA1300－35Snos的重组

该实验是用EcoRI和HindIII两种酶酶切pCAMBIA1300回收大片段作为载体，酶切

pROKII回收小片段（35Snos）作为外插DNA与载体进行连接，这个实验是一个双酶切连

接实验；双酶切连接实验是质粒重组中最简单的一种实验，成功率极高。

2.1.1 质粒pCAMBIA1300与pROKII的提取。

质粒pCAMBIA1300在大肠杆菌中拷贝数很高，用小量制备方法提取即可，起始菌液为3ml

（1.5ml管回收菌液两次），提取过程中注意动作要轻柔，最后在用22ul TER溶解DNA，取

1ul溶解好的DNA电泳看提取效果。质粒pROKII的拷贝数较低，采用中量制备方法提取。

2.1.2 双酶切质粒

80ul酶切体系EcoRI与HindIII各加1ul，质粒pCAMBIA1300酶切2ug，pROKII酶切8ug，

酶切反应过夜从晚6点切到次日早晨8点，加入电泳上样BUFFER中止反应。

2.1.3 回收与定量

酶切产物经琼脂糖电泳后切胶回收，电泳时间可以比普通电泳适当长些，切胶要快要准，用Kit回收后取1ul电泳定量。由于pROKII是低拷贝，若提取的质粒量不到8ug比如只有4ug 那么酶切回收小片段的量可能会很少，这时可以将回收物开盖放置于60度水浴锅中将其浓缩一下。注意：小片段可以浓缩，载体大片段不建议进行浓缩。

2.1.4 连接与转化

10ul连接体系，加1ul 10Χbuffer、0.5ul连接酶，载体加80ng，由于载体（8kb左右）分子量是外插（35snos约1kb左右）是的8倍，所以外插加入30ng即可。16度连接过夜。次日取5ul连接产物转化大肠杆菌。

2.2 pCAMBIA1300－ubiiptnos的重组

本实验用KpnI单酶切质粒pCAMBIA1300－ubinos和Teasy－ipt分别回收载体与ipt基因片段进行连接，这是一个单酶切连接实验。单酶切连接实验比起双酶切连接实验来说需要多注意的一步是载体脱磷反应，这一步如果做的好的话那么实验成功率也是极高的。

2.2.1当酶切载体后载体是5’突出粘末端时，那么在过夜的酶切产物中直接加入1ul的CIAP 酶，37度反应36分钟即可加入上样buffer 中止反应，电泳回收即可。

2.2.2 如果酶切载体后载体是3’突出粘末端，比如本实验kpnI酶切后载体就是3’突出的，5’端的磷酸基团是在里边的；这种情况时，我是在酶切时用30ul的酶切总体系，用1ul的酶过夜酶切2ug的pCAMBIA1300－ubinos质粒，然后加入7ul的10Χ CIAP buffer，1ul的CIAP 酶，加ddH2O到总体积为100ul，50度反应半个小时后中止反应电泳回收。

2.2.3 其它注意事项同双酶切连接实验

附：感受态的制备与连接产物的转化步骤

1．CaCl2 法制备感受态细胞

1.1从37ºC 培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有10mlLB培养基的100ml烧瓶中，37ºC 剧烈震荡培养约3小时，至OD600值为0.2-0.3。

1.2将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、冰预冷的7ml聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷至0ºC 。

1.3于4ºC 以5000rpm离心10分钟，以回收细胞。

1.4倒出培养液，将管倒置至少一分钟，使培养液流干净。

1.5每5ml培养液用2ml预冷的0.1mol/l的CaCl2重悬细胞，冰上放置10分钟。