蓝藻蛋白的分离与纯化

藻蓝蛋白的分离与纯化

一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；

2、掌握蛋白含量测定方法；掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。

二、实验原理

藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等）本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的，含量，考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm 变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm 处吸光值成正比。离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH 或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8 之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3，在PH6.5 磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。

三、试剂与仪器

1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PH6.5）、标准蛋白（0.1mg/L）、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE 纤维素、奈氏试剂

四、实验步骤

（一）、藻蓝蛋白的提取及初步纯化

1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。具体操作：取螺旋藻粉1g，加入0.01mol/LPH6.5 的磷酸盐缓冲液10mL，充分搅拌混匀。室温浸泡30min-1h 后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5 次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL0.01moL/L PH6.5 的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min，4000r/min 离心20min ，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。

2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min ，然后4000r/min 离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min，4000r/min 离心20min，弃去上清液，离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。

3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5 的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔1h 换一次透析液，换3-4 次。(二)藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线；2、样品含量测定；3、计算结果。具体操作步骤如下：取洁净干燥的试管若干，按表1-1 比例配置标准蛋白溶液。原本标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。表1-1 标准溶液配置管号标准蛋白（mL）蒸馏水（mL）1 0 1 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 混匀此6 组试管中的标准蛋白溶液，分别加入4mL 考马斯亮蓝G-250，摇匀(充分混匀)，室温放置5min 后在595nm 波长处别色，以1 号试管调零点，得到5 组标准蛋白溶液在595nm 处的吸光值A595。以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，以A595 值为纵坐标作图，得到的趋势线即标准曲线。将提取的藻蓝蛋白溶液1mL 适当稀释（6-10 倍左右），再取0.2mL，补充水到1mL，同上进行比色操作，得到其595nm 处的吸光值，通过标准曲线推算其含量。（三）藻蓝蛋白纯度的测定测定A620 和A280 值，纯度可用A620/A280 来表示。将上述稀释后的样品，用可见分光光度计，测定其在620nm 波长处的

吸光值A620；再将样品转出，装入石英比色皿，放入紫外分光光度计，测定其在280nm 波长处的吸光值A280。由于藻蓝蛋白在620nm 波长处有特征吸收峰，其纯度可以用A620/A280 来表示。因此，根据在可见和紫外分光光度计中得到的数据就可以推算出提取的藻蓝蛋白样品的纯度。

（四）藻蓝蛋白的进一步纯化

1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡

2、上样、洗脱

3、测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。

具体操作：3.测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。具体操作：用三倍柱床体积的0.01mol／LpH6.5 磷酸盐缓冲液平衡。将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱，采用0.01mol／LpH6.5 磷酸缓冲液洗脱（含0.4mol ／LNaCI）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。流速控制在10d／min，用小试管收集洗脱液，每管收集2mL（或30 滴），收集10-12 管（呈现蓝色的液体内含有目的蛋白）。测定每管样品的A620，横横坐标洗脱体积、纵坐标A620 值，绘制洗脱曲线。合并所有管中的样品，A620 和A280 值，计算纯度。然后用0.01mol／LpH6.5 磷酸缓冲液（含0.6mol／LNaCI）洗脱，洗脱下的是藻蓝蛋白。

柱料的再生：用0.5ml／LHCl 溶液处理柱料，洗2-3 倍柱床体积，用水洗至pH6.0,0,01mol／LpH6.5 磷酸缓冲液平衡。四、数据处理及实验结果