三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较

定量pcr：以参考物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达成评定样本中靶基因拷贝数，称为定量PCR。定量PCR可行性定量通常是在PCR扩增指数期进行。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：

(1) SYBR Green I 检测模式

SYBR Green I 是一个能和双链DNA 结合发光荧光染料。其和双链DNA 结合后，荧光大大增强。所以，SYBR Green I 荧光信号强度和双链DNA 数量相关，能够依据荧光信号检测出PCR 体系存在双链DNA 数量。SYBR Green I 最大吸收波长约为

497nm，发射波长最大约为520nm。PCR 扩增程序通常为94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。SYBR Green I 缺点：因为SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定双链，只要是双链就会结合发光，对PCR 反应中非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I 优点：SYBR Green I 优点是因为其缺点产生，因为它能全部双链DNA 相结合，所以对不一样模板不需尤其定制不一样特异性探针，通用性很好，而且价格相对较低。这对科研是很有利，所以中国外在科研中使用比较普遍。

(2) 水解探针模式(taq man探针)

TaqMan 探针是一个寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针和靶序列配对时，荧光基团发射荧光因和3’端淬灭剂靠近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团和淬灭剂分离，发射荧光。一分子产物生成就伴伴随一分子荧光信号产生。伴随扩增循环数增加，释放出来荧光基团不停积累。所以Taqman 探针检测是积累荧光。PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。常见荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)

分子信标是一个呈发夹结构茎环双标识寡核苷酸探针，两端核酸序列互补配对，所以标识在一端荧光基团和标识在另一端淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标茎环结构中，环通常为15-30 个核苷酸长，并和目标序列互补;茎通常5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎结构。荧光基团标识在探针一端，而淬灭剂则标识在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配正确茎环双链解开，假如有模板存在环序列将和模板配对。和模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团和淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。因为是酶切作用存在，分子信标也是积累荧光。常见荧光基团：FAM ，Texas Red 。PCR 扩增程序通常是：94～55～72 ℃三步法，40 个循环。

FRET 探针又称双杂交探针，FRET 探针由两条相邻探针组成，在一条探针5`端标识FAM 荧光基团，另一探针3`端标识Red 640 荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM 基团和Red640 基团相邻，激发FAM 产生荧光，作为Red640 基团激发光被吸收，使Red640发出波长为640 荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640 波长荧光。因为FRET 探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常见荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。

能用于实时荧光PCR 定量方法很多，各有优缺点，应依据试验需要和目前试验条件选择适合自己方法。下面为多种方法比较：

试验中部分好习惯：

加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完以后要归到最大计量位置，预防久而久之弹簧失去弹性。

一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注她人讨论经验，这几乎是最快提升捷径了;全部试剂全部自己配，出了问题才好找原因。

预防RNA酶污染方法：

1. 全部玻璃器皿均应在使用前于180℃高温下干烤6h或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。

3. 有机玻璃电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

4. 配制溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌试剂，应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。

常见RNA酶抑制剂：

1. 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一个强烈但不根本RNA酶抑制剂。它经过和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶活性。

2. 异硫氰酸胍：现在被认为是最有效RNA酶抑制剂，它在裂解组织同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶活性。

4. RNA酶蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶一个非竞争性抑制剂，能够和多个RNA酶结合，使其失活。

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

因为DEPC不加选择修饰蛋白质和RNA，所以在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它和部分缓冲液(比如Tri)不能相容

在全部RNA试验中，最关键原因是分离得到全长RNA。而试验失败关键原因是核糖核酸酶(RNA酶)污染。

RNA酶可耐受多个处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成污染RNA酶最关键潜在污染源是研究人员手。所以进行RNA试验时应勤换手套。

但DEPC能和胺和巯基反应,所以含Tris和DTT试剂不能用DEPC处理