【精品课件】液相色谱的柱和系统故障检修
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色谱柱和色谱系统的故障检修及维护
缓冲液应用的几点建议缓冲液可以提供离子平衡的反离子，并使流动相保持一定的离子强度和ph值，减少拖尾。
但是使用缓冲液要注意几点1：避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。
2：缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。
3：实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会处使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。
4：使用缓冲液要及时掌握ph范围，做到胸中有数。
5：清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。
6：长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路（拆下柱子，走30ml,再用5倍水冲洗）可以避免液路的堵塞。
7：选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。
6:溶剂过滤器是液相色谱常用的辅助设备，用来过滤流动相；使用注意以下事项1:溶剂过滤器是易碎品，切不可整体搬移，特别不能拿着夹子搬移2:过滤膜选择要选择合格产品，不合格的会溶进杂质，可用待过滤的溶剂浸泡24小时看有无溶解现象，以考察过滤膜质量。
3过滤膜分有机和水系，要区分开。
4:水系过滤，有机用有机膜，最好过滤后再混合，混合后的流动相用哪个比例大用哪种膜。
5：膜不分反正，但最好光滑一面向上，粗糟一面向下过滤效果会好。
6:废弃过滤膜不要随意丢弃，过滤膜对环境有污染，不宜绛解。
收集统一处理。
7:溶剂过滤器配套的无油真空泵抽气时，不要等液体空后再拔软管，不宜拔出，会压扁软管，剩一点液时就停泵。
口8过滤好的溶剂要避免二次污染。
9:给色谱柱加温，温度升高的目的，部分在于增加溶质的溶解度，但更重要的是降低溶剂的黏度，从而改进峰形和分离度。
注意：温度升高会降低保留时间，这对分离度也有影响，温度的变化对谱带宽度的影响甚大，而塔板高度受温度的影响虽然也取决于所采用的色谱类型，而温度升高总是要降低塔板高度的。
问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?答：关于漂移问题：1温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题1流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
液相色谱仪日常维护及常见故障解决精品PPT课件
流动相内含有空气 - 脱气处理 检测池内有气泡 - 冲洗检测池或在检测池出口接一段内径0.009“的
管子(此法只适用于耐压检测器 !!!) 色谱柱内有未洗脱尽的组份 - 洗脱色谱柱. 系统有漏液之处 - 检漏并处理 电噪声 - 去除噪声源, 信号线屏蔽, 检查系统接地状况 检测器光源灯能量低 - 更换光源灯 检测池污染 - 冲洗检测池
逻辑判断及处理
化学品
*色谱柱/保护柱 *溶液 *样品
问题
环境
*电源 *地线 *温度 *湿度
*清洁程度
机器
*泵 *进样器 *检测器 *数据处理单元
液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手
1.从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化 2.从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、峰形 3.从数据结果中分析
典型故障分析及实例基线噪声
流动池污染后，会造成灵敏度下降、 噪声加大，应避免脏的样品进入流动 池。定期使用异丙醇冲洗系统对保持 流动池性能有一定好处。
更换氘灯。
二、液相色谱仪故障分析
能引起HPLC发生问题的潜在因素:
工作环境 流动相 进样器 在线过滤器 色谱柱 数据处理装置
电源及地线 泵 保护柱 连接管路 检测器 操作
一、液相色谱仪日常维护及注意事项
1 流动相 2 脱气机（在线） 3 泵（单元、二元、四元） 4 进样器（手动、自动） 5色谱柱 6 检测器(VWD/DAD/FLD/RID…)
1 流动相
溶剂 乙睛
水 环己烷 己烷 甲醇 乙醇 乙醚 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳 四氢呋喃 甲苯
UV截止波长（nm） 190 190 195 200 210 210 220 220 240 265
色谱柱保护
色谱柱的再生
进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色 谱仪上的泵。
管子(此法只适用于耐压检测器 !!!) 色谱柱内有未洗脱尽的组份 - 洗脱色谱柱. 系统有漏液之处 - 检漏并处理 电噪声 - 去除噪声源, 信号线屏蔽, 检查系统接地状况 检测器光源灯能量低 - 更换光源灯 检测池污染 - 冲洗检测池
逻辑判断及处理
化学品
*色谱柱/保护柱 *溶液 *样品
问题
环境
*电源 *地线 *温度 *湿度
*清洁程度
机器
*泵 *进样器 *检测器 *数据处理单元
液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手
1.从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化 2.从色谱图的异常情况推测，如出峰时间、峰形 3.从数据结果中分析
典型故障分析及实例基线噪声
流动池污染后，会造成灵敏度下降、 噪声加大，应避免脏的样品进入流动 池。定期使用异丙醇冲洗系统对保持 流动池性能有一定好处。
更换氘灯。
二、液相色谱仪故障分析
能引起HPLC发生问题的潜在因素:
工作环境 流动相 进样器 在线过滤器 色谱柱 数据处理装置
电源及地线 泵 保护柱 连接管路 检测器 操作
一、液相色谱仪日常维护及注意事项
1 流动相 2 脱气机（在线） 3 泵（单元、二元、四元） 4 进样器（手动、自动） 5色谱柱 6 检测器(VWD/DAD/FLD/RID…)
1 流动相
溶剂 乙睛
水 环己烷 己烷 甲醇 乙醇 乙醚 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳 四氢呋喃 甲苯
UV截止波长（nm） 190 190 195 200 210 210 220 220 240 265
色谱柱保护
色谱柱的再生
进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色 谱仪上的泵。
液相色谱常见问题PPT课件
2
液相色谱容易出问题的部件
维护流程图
线路过滤器
单向阀
检测器 柱塞密封圈 手谱容易出问题的部件
单向阀结构
宝石球 抛光面
透明塑料垫片 流动相
单向阀原理
吸液冲程
排液冲程
出口单向阀
泵头
进口单向阀
4
液相色谱容易出问题的部件
单向阀
故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，
1、在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3
ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样
处理
2、定期使用强溶剂冲洗柱子
3、使用缓冲盐时，要先用低浓度含水有机溶剂冲洗，
再用纯有机溶剂冲洗
4、净化样品
5、分离条件
6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯
7、使用预柱
8、避免流动相组成及极性的剧烈变化
措施：5％稀硝酸，超声波清 洗
流动相
压力传感器 判断依据：关闭排液阀，断开出
口管路，设定流速1mL/min，
排液阀
如压力>3kgf/cm2，则可能堵 塞。
7
液相色谱容易出问题的部件
延长柱寿命方法： 倒冲柱 换过滤片 修补柱头
8
液相色谱容易出问题的部件
柱的补修
9
液相色谱容易出问题的部件
分析柱的维护
液相色谱常见问题及解决 方法
解决方案
1
溶剂的过滤 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不
适 用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂
液相色谱容易出问题的部件
维护流程图
线路过滤器
单向阀
检测器 柱塞密封圈 手谱容易出问题的部件
单向阀结构
宝石球 抛光面
透明塑料垫片 流动相
单向阀原理
吸液冲程
排液冲程
出口单向阀
泵头
进口单向阀
4
液相色谱容易出问题的部件
单向阀
故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，
1、在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3
ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样
处理
2、定期使用强溶剂冲洗柱子
3、使用缓冲盐时，要先用低浓度含水有机溶剂冲洗，
再用纯有机溶剂冲洗
4、净化样品
5、分离条件
6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯
7、使用预柱
8、避免流动相组成及极性的剧烈变化
措施：5％稀硝酸，超声波清 洗
流动相
压力传感器 判断依据：关闭排液阀，断开出
口管路，设定流速1mL/min，
排液阀
如压力>3kgf/cm2，则可能堵 塞。
7
液相色谱容易出问题的部件
延长柱寿命方法： 倒冲柱 换过滤片 修补柱头
8
液相色谱容易出问题的部件
柱的补修
9
液相色谱容易出问题的部件
分析柱的维护
液相色谱常见问题及解决 方法
解决方案
1
溶剂的过滤 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不
适 用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂
[课件]常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT
![[课件]常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/0f2fca3cb7360b4c2e3f64f8.png)
能团与Si-OH 键合）→端基封口（对残余的Si-OH 用小分子的氯-甲基、氯乙基键合 ）→润湿混合（加乙醇等调匀，其配方各厂家均有专利保护）→ 装填（机械装填或手工装填，层层装填，压紧，润湿）→高压平衡（轴向加
压或径向加压，各厂家均有专利保护）→干燥（此步为关键工艺步骤，各厂
家均有专利保护）→削平→组件安装→预平衡→柱效测试流动相平衡→柱效 测试→封口→包装
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
+ 1.3
液相色谱柱的分类与应用范围 分类方法很多，可按键合相类型、用途（分析 型与制备型）、基质种类等进行分类。 1.3.1硅胶基质柱（4大类）
目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为： 高纯硅胶柱：以高纯度硅烷化硅胶（Silica）为填料，应用范 围较广，但只能在PH2.0-7.5，小于60度的条件下使用。又由 于强极性硅羟基（Si-OH)的次级保留效应较强，所以应用受 到局限，已被键合相柱所取代。 反相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合弱极性官能 团的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、 C6H5（phenyl，苯基）等。用于分离大多数有机化合物，应 用范围最广。
1.3.5.4其他无机物填料柱
如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。
1.4液相色谱柱制备工艺简述
不同品牌色谱柱制备工艺各异，但都可归纳为如下流程 （以硅胶柱为例）：
硅烷化硅胶制备（四乙氧基硅烷脱乙基与聚合）→Si-OH 基暴露（ 脱乙基， 置换成H）→海绵状多孔硅胶构造（物理匀质过程）→官能团键合（各种官
异构体；氧化铝柱刚性强，柱床稳定，可分离多种化合物且多
常用液相色谱柱原理及使用与维护保养ppt课件
液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板 （滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系 列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。 运载溶剂（Shipping Solvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后 饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。 保存条件（Storage Conditions）：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及 其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同 要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净 化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温度。 保存溶剂（Storage Solvent）：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与
离子基团（磺酸盐/季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、
弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类 化合物。（注意：不要同离子色谱混淆，离子色谱主要是分离 无机盐类化合物或某些带点离子。）
6
1.3.2聚合物基质柱
聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙 烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色 谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的pH范围 （1.0～14.0），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱 （GPC）、凝胶过滤色谱（GFC）及分子排阻色谱（MEC）。 主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。
属中等级性柱，普适性 好；保留适中，可用于 正相与反相。
适用于在ODS上无保留或分离 时间太长的组分的分离，以及样 CN（氰基） 品中同时含有亲水与疏水性化合 物而在ODS上色谱优化困难的 场合，也可用于氨基酸分析。
液相色谱常见问题及其对策-三PPT课件
堵塞
检查进样针头是否堵塞、进样阀是否 损坏、管路是否畅通等，采取相应措 施进行疏通或更换。
泄漏
检查接口是否松动、密封垫是否老化 、管路是否破损等，及时紧固或更换 相关部件。
其他辅助设备故障处理
柱温箱故障
检查温度传感器是否损坏、加热 元件是否正常工作、控温系统是 否稳定等，根据情况进行维修或
更换。
脱气机故障
考虑方法的回收率、精密度、准确性和操作简便性等因素。
对于复杂样品，可能需要采用多种前处理方法的组合。
避免干扰物质引入
使用高纯度的试剂和清洁的容器和设备，以减少干扰 物质的影响。
在前处理过程中，要注意避免引入干扰物质，如试剂 中的杂质、容器和设备的污染等。
对于可能引入干扰物质的步骤，要进行严格的控制和 验证。
流动相通过固定相时，与固定相 发生作用（吸附、分配、离子交 换等），使各组分在两相间的分
配系数发生变化。
反复多次利用上述过程，各组分 在移动速度上产生较大的差别， 被分离成单个组分依次从柱内流
出。
系统组成及功能
进样系统
将样品注入色谱柱。
检测系统
检测色谱柱流出物 的组分及含量。
输液系统
提供稳定、可调的 流动相流速。
自动化前处理技术可以减少人为操作误差和样品交叉污染的风险。
在使用自动化前处理技术时，要注意设备的维护和校准，确保设备的正常运行和准确性。
06 环境条件改善举措
实验室温湿度控制要求
1 2
温湿度对液相色谱仪器的影响
过高或过低的温度和湿度可能导致仪器性能不稳 定、色谱柱效降低等。
温湿度控制标准
建议将实验室温度控制在20-25℃，相对湿度保 持在40%-60%之间。
检查进样针头是否堵塞、进样阀是否 损坏、管路是否畅通等，采取相应措 施进行疏通或更换。
泄漏
检查接口是否松动、密封垫是否老化 、管路是否破损等，及时紧固或更换 相关部件。
其他辅助设备故障处理
柱温箱故障
检查温度传感器是否损坏、加热 元件是否正常工作、控温系统是 否稳定等，根据情况进行维修或
更换。
脱气机故障
考虑方法的回收率、精密度、准确性和操作简便性等因素。
对于复杂样品，可能需要采用多种前处理方法的组合。
避免干扰物质引入
使用高纯度的试剂和清洁的容器和设备，以减少干扰 物质的影响。
在前处理过程中，要注意避免引入干扰物质，如试剂 中的杂质、容器和设备的污染等。
对于可能引入干扰物质的步骤，要进行严格的控制和 验证。
流动相通过固定相时，与固定相 发生作用（吸附、分配、离子交 换等），使各组分在两相间的分
配系数发生变化。
反复多次利用上述过程，各组分 在移动速度上产生较大的差别， 被分离成单个组分依次从柱内流
出。
系统组成及功能
进样系统
将样品注入色谱柱。
检测系统
检测色谱柱流出物 的组分及含量。
输液系统
提供稳定、可调的 流动相流速。
自动化前处理技术可以减少人为操作误差和样品交叉污染的风险。
在使用自动化前处理技术时，要注意设备的维护和校准，确保设备的正常运行和准确性。
06 环境条件改善举措
实验室温湿度控制要求
1 2
温湿度对液相色谱仪器的影响
过高或过低的温度和湿度可能导致仪器性能不稳 定、色谱柱效降低等。
温湿度控制标准
建议将实验室温度控制在20-25℃，相对湿度保 持在40%-60%之间。
高效液相色谱仪器故障的诊断与维修-ppt课件.ppt
峰变宽 漏夜
故障排除 增加浓度 使系统到达平衡 检查进样器 使用柱温箱
检查漏夜的位置并维修
出现两个或多个未被完 选择其它色谱条件以改善分离
全分离的物质的峰
效果
检测器时间常数太大 使用较小的时间常数
ppt课件
11
4.峰分叉
现象
判断
柱性能下降
保护柱失效
故障排除 更换色普柱 换柱芯
峰分叉
色谱柱或保护柱被污染 清洗柱或保护柱，必要时更换
检测池被污染或有气体
用甲醇或其他强极性的溶剂冲 洗流通池
ppt课件
21
现象
判断
故障排除
测定的波长选择有误 基线漂移
使用分光光度计说明背景吸收， 如背景值高，说明流动相含有 紫外吸收化合物导致基线漂移。 使用的流动相应在紫外截止波 长以外，或更换溶剂
系统泄漏
检查并进行维修
样品中有强保留的物质 用强度合适的溶剂清洗色谱柱
判断
故障排除
样品前处理时产生降解 用标准品对照、检查样品处理过
或混入杂质
程，换新样品
色谱图出 现鬼峰 前一次进样的洗脱物
增加分析时间或梯度洗脱、提高 流速、如问题仍存在，两次进样 间用强溶剂冲洗色谱柱
注射器脏
清洗注射器、冲洗进样口
ppt课件
15
现象
判断
故障排除
流动相被污染
清洗溶剂贮液瓶、清洗溶剂入 口过滤器、使用HPLC级试剂
衡
统平衡
室温不稳
基线漂移 流动相污染或分解
使用柱温箱、将系统置于恒温、 空气对流小的环境
清洗溶剂贮液瓶、清洗溶剂入 口过滤器、使用HPLC级试剂
流动相脱气不充分
脱气重新平衡系统
精选液相色谱的柱和系统故障检修资料
7/4/2019
24
峰变宽,裂开 柱塌陷（迟到的峰）
Column: Extend-C18, 4.6 × 150 mm, 5 µm
Mobile Phase: 40% 10 mM TEA, pH 11 : 60% MeOH
Flow Rate: 1.0 mL/min UV 254
Temperature: R.T.
Low Load 低载负
1.70 1.90 1.56 1.70 1.86 1.25
Plates 理论板数 High Load / 10 高载负/10倍
850 815 2776 2539 2735 5189
Low Load 低载负
5941 7842 6231 8359 10022 10725
7/4/2019
7/4/2019
14
裂峰
柱污染
Column: StableBond SB-C8, 4.6 × 250mm, 5µm
Mobile Phase:60%25mM Na2HPO4,pH3.0 : 40%MeOH
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35ºC
Detection: UV 254 nm
Detection:
Sample: 1. Maleat 顺丁烯二酸
2. Pseudeophedrine 伪
麻黄碱 3. Chlorphenniramine 氯非尼拉明
理论板数
极低的理论板数表明这是一个前面进样极迟洗脱出来的 峰
7/4/2019
25
峰拖尾
进样器密封性差
Column: Bonus-RP, 4.6 × 75mm, 3.5µm
Plates TF 理论板数 拖尾因子
色谱柱和色谱系统的故障检修.pptx
2021/1/12
6
Column Cleaning柱子清洗
Normal Phase Solvent Choices in Order of Increasing Strength
为了增加强度选用正相溶剂
Use at least 50 ml of each solvent 每种溶剂至少用50 ml
50% Methanol : 50% Chloroform 50% 甲醇 : 50% 氯仿
2021/1/12
4
Determining the Cause and Correcting
High Back Pressure 查出原因 纠正压力
Check pressure with/without column - many pressure problems are due to blockages in the system or guard 有／无柱子时检查压力 － 许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞
100% Ethyl Acetate 乙酸乙酯
2021/1/12
7
How to Change a Frit 怎样更换滤头
Column Inlet Frit 柱进口滤头 Column Body 柱身 Compression Ferrule 压缩金属套圈
Wear gloves 戴手套 Do not allow bed to dry 不要让底座干燥 Do not touch the column-body heat will extrude packing 不要使柱身受热,否则填料会喷出 Do not over tighten 不要旋得太紧
Female End Fitting 旋好尾端螺母 Male End Fitting 旋好尾端螺头
最新2019-高效液相色谱常见故障及解决方案-PPT课件
解
流动相脱气不充 分
故障排除 分析之前应有足够的 时间使系统平衡 使用柱温箱、将系统 置于恒温、空气对流 小的环境 清洗溶剂贮液瓶、清 洗溶剂入口过滤器、 使用HPLC级试剂
脱气重新平衡系统
现象
判断
故障排除
流动相配比不当 或流速变化
更改配比或流速
柱被污染
冲洗柱或更换柱
基线漂
移
固定相流失
为说明问题存在，用 一段连接管路代替色 谱柱，通流动相检测 基线
故障排除
用标准品对照、检查样 品处理过程，换新样品
色谱图
出现鬼 前一次进样的洗
峰
脱物
增加分析时间或梯度洗 脱、提高流速、如问题 仍存在，两次进样间用 强溶剂冲洗色谱柱
注射器脏
清洗注射器、冲洗进样 口
现象 判断
故障排除
流动相被污染
清洗溶剂贮液瓶、清 洗溶剂入口过滤器、 使用HPLC级试剂
柱被污染
色谱图 出现鬼
流动相选择不当 选择恰当的流动相
3.峰变宽
现象 判断
故障排除
柱性能下降
更换色谱柱
保护柱失效
换柱芯
色谱柱或保护柱 峰变宽 被污染
色谱柱选择不当
清洗柱或保护柱，必 要时更换
选择恰当的色谱柱
流动相选择不当 选择恰当的流动相
流动相流速太低 调节流速
现象
判断 缓冲液浓度太低 系统没到达平衡 进样器问题 环境温度变化
溶剂配比不合适 调节溶剂配比
进样体积太大或 样品浓度太高
减小进样体积
9.保留时间不断变化
现象 判断
故障排除
流速变化
重新设定流速,检查泵 是否正常工作
系统没有达到平 衡 保留时 间不断 柱被污染 变化
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峰拖尾柱“次级效应”（PH值）
Column: Alkyl-C8, 4.6 × 150mm, 5µm
Mobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACN
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35ºC
Sample: 1. Phenylpropanolamine 苯丙醇胺／去甲麻黄碱
4. Chlorpheniramine
Injection 1 峰3 峰形较好
Injection 30 峰3 裂峰
Injection 1 After Column Wash with 100% CAN
经100%乙腈冲洗后 峰3 峰形极好
裂峰
溶剂化效应
Column: StableBond SB-C8, 4.6 × 250mm, 5µm Mobile Phase: 82%H2O : 18%ACN Injection Volume: 30 µL Sample: 1. Caffeine 咖啡因 2. Salicylamide 水杨酰胺
A. Injection Solvent 100% Acetonitrile 峰形宽拖尾
B. Injection Solvent Mobile Phase 峰形尖锐对称
样品溶剂尽可能与流动相匹配
裂峰原因的确定
复杂样品的基质或分析许多样品 ------ 柱污染或部分阻塞滤片
流动相 pH>=7 ------ 由于硅胶溶解使柱塌陷(除非使用专门的柱子) --------预柱与柱的塌陷
对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 冲洗 没有缓冲盐的流动相 100% Methanol 甲醇 100% Acetonitrile 乙腈 75% Acetonitrile :25% Isopropanol 75 %乙腈 ：25％异丙醇 100% Isopropanol 异丙醇 100% Methylene Chloride★ 二氯甲烷 100% Hexane ★ 已烷 当用已烷蔌二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流 动相
柱子清洗
为了增加强度选用正相溶剂
或：
每种溶剂至少用50 ml
50% 甲醇 : 50% 氯仿 乙酸乙酯
怎样更换滤头
柱进口滤头 戴手套 不要让底座干燥 不要使柱身受热,否则填料会喷出 不要旋得太紧 旋好尾端螺母 旋好尾端螺头
压力问题的预防
柱保护 保护柱/预柱
在线过滤器 样品预处理 适当的柱冲洗 过滤缓冲流动相
No TEA 无三乙胺
10 mM TEA 10 mM 三乙胺
USP TF(5%) 美国药典拖尾因子
USP TF(5%) 美国药典拖尾因子
1.91
2. 1.18
3. 1.63
3. 1.20
4. 2.35
4. 1.26
5. 1.57
5. 1.14
用流动相减尾剂(三乙胺)在pH 7 消除峰拖尾
Analytical Column
分析柱
To Detector 到检测器
压力问题的预防:样品制备
溶剂/化学环境 微粒/凝聚物的除去
Filter samples 过滤样品 Centrifugation 离心分离 固相萃取 薄层板 生物膜
B峰形问题
Split peaks 裂峰 Peak tailing 峰拖尾 Broad peaks 宽峰 Poor efficiency 低柱效
有／无柱子时检查压力 ①去柱后 ②去柱前 ③去预柱…………. 许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞
如果柱压高: ①冲洗柱子:排除柱污染和填料堵塞
包括：高分子量／被吸附化合物 样品或缓冲液中的沉淀物
②反冲柱子－清洁阻塞的滤头 ③更换滤头
Column Cleaning 柱子清洗
用比你的流动相更强的溶剂冲洗 为了增加强度选择反相溶剂
色谱柱和色谱系统的故障检修
六、
HPLC 的组成
泵 进样器/自动进样器 色谱柱 检测器 数据系统/积分仪表
所有这些部件可能出现故障而需要检修。
HPLC 的组成
色谱柱问题的类型
A. 压力 B. 峰形 C. 保留时间
色谱柱观测 压力高
A压力问题
潜在的问题
堵塞滤头 色谱柱污染 堵塞填料
查出原因 纠正压力
样品的量大 ------裂峰和宽峰,由样品量来决定
峰拖尾、变宽和柱效降低
可能的原因
柱“次级效应”（硅醇基效应） 柱塌陷 柱污染 柱老化 柱负荷超载 柱外效应
峰拖尾柱“次级效应”（扫尾剂）
Column: Alkyl-C8, 4.6 × 150mm, 5µm
Mobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACN
Column: StableBond SB-C8, 4.6 × 250mm, 5µm
Mobile Phase:60%25mM Na2HPO4,pH3.0 : 40%MeOH
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35ºC
Detection: UV 254 nm
Sample: 1. Pseudoephedrine 2. APAP 3. Unknown
压力问题的预防:在线装置
Mobile Phase From Pump 从泵来的流动相
Pre-Column 预柱
Injector Filter Guard 进样器 滤头 Column
保护柱
Filter and Guard Column Act on Sample 滤头和保护柱作用于样品
Pre-Column Acts on Mobile Phase 预柱作用于流动相
Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: 35ºC
Sample: 1. Phenylpropanolamine 苯丙醇胺／去甲麻黄碱 2. Ephedrine 麻黄碱 3. Amphetamine 安非他明／苯丙胺 4. Methamphetamine 脱氧麻黄碱 5. Phenteramine 苯三胺
许多峰形问题是结合在一起的-例如: 展宽和拖尾或拖尾和保留时间增加
裂峰
可能的原因:
Column contamination 柱污染 Partially plugged frit 部分阻塞滤片 Column void 柱头塌陷 Injection solvent effects 溶剂效应
裂峰
柱污染