目的基因的获得酵母双杂交
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS， 并可与之结合；
Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合， 激活UAS下游报告基因LacZ的转录。
三、酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
AD
Y
lacZ(or HIS) reporter gene
X
DNA-BD
GAL4 UAS
AD
Y
Promoter
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
1. 结构域（Domain）合作
许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结 构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域 组成。
二、酵母双杂交系统的建立
经典文献出处
Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246
1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵 母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。
Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天 然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多 肽链。
两个结构域中的BD由位于N-末端的1～147位多肽 构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一 段核定位序列。
该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子 的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：
转录激活因子
DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活结构域(AD) (activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响，单 独存在时没有转录激活的功能，只有两者通 过共价或非共价键连接建立起来的空间结构 方可表现出一个完整的激活特定基因表达的 激活因子的功能。
通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落
四、酵母双杂交系统的基本策略
表达“诱饵”和“猎物”蛋白； 检验这两种蛋白表达Biblioteka Baidu能否激活酵母中的报告基因。
做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白 的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。
酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 易于转化、便于回收扩增质粒 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相
互结合
改造后的酵母细胞的特点：
基因组中GAL4基因是缺失型的 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS
例如：
啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:
1-147aa
768-881aa
N DNA binding domain
Active domain C
结合
结合
激活转录
上游激活序列（UAS） 转录激活 GAL4效应基因
实验发现：
转录表达
只要DNA binding domain（DNA-BD） 与Active domain（AD）靠近就能激活转录。
一、酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行 的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间 微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物 敏感地检测得到。
它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系 的技术。
该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白 质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编 码的蛋白质之间的相互作用。
其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 已知可以相互作用的。
当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告 基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作 用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的 复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。
2. 拆开 Domain
用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开， 就丧失了激活效应基因的能力。
Active domain
DNA binding domain 结合
上游激活序列（UAS） 转录激活
GAL4效应基因
不能转录
3. 重组Domain
用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不 同的多肽连接。
蛋白B Active domain DNA binding domain 蛋白A
4. 观察报告基因表达
在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。
蛋白A
蛋白B
（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 GAL4的BD domain与AD Domain也不能靠近， 所以仍然不能启动效应基因的转录。
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和 Gal4 系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合域由一个完整的原核蛋 白LexA 构成，转录激活域则由一个88 个氨基酸的 酸性的大肠杆菌多肽B42 构成，它在酵母中可以活 化基因的转录;
在Gal4 系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同 的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
上游激活序列（UAS）转录激活 GAL4效应基因
转录表达
双杂交原理
X基因和Y基因产物 的相互结合，导致 reporter gene表达。
Reporter gene表达就 说明X基因产物与Y 基因产物能结合。
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞
AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。 Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空 间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿 梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋 白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋 白SNF4融合。
Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合， 激活UAS下游报告基因LacZ的转录。
三、酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
AD
Y
lacZ(or HIS) reporter gene
X
DNA-BD
GAL4 UAS
AD
Y
Promoter
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
1. 结构域（Domain）合作
许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结 构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域 组成。
二、酵母双杂交系统的建立
经典文献出处
Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246
1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵 母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。
Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天 然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多 肽链。
两个结构域中的BD由位于N-末端的1～147位多肽 构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一 段核定位序列。
该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子 的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：
转录激活因子
DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活结构域(AD) (activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响，单 独存在时没有转录激活的功能，只有两者通 过共价或非共价键连接建立起来的空间结构 方可表现出一个完整的激活特定基因表达的 激活因子的功能。
通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落
四、酵母双杂交系统的基本策略
表达“诱饵”和“猎物”蛋白； 检验这两种蛋白表达Biblioteka Baidu能否激活酵母中的报告基因。
做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白 的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。
酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 易于转化、便于回收扩增质粒 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相
互结合
改造后的酵母细胞的特点：
基因组中GAL4基因是缺失型的 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS
例如：
啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:
1-147aa
768-881aa
N DNA binding domain
Active domain C
结合
结合
激活转录
上游激活序列（UAS） 转录激活 GAL4效应基因
实验发现：
转录表达
只要DNA binding domain（DNA-BD） 与Active domain（AD）靠近就能激活转录。
一、酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行 的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间 微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物 敏感地检测得到。
它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系 的技术。
该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白 质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编 码的蛋白质之间的相互作用。
其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 已知可以相互作用的。
当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告 基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作 用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的 复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。
2. 拆开 Domain
用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开， 就丧失了激活效应基因的能力。
Active domain
DNA binding domain 结合
上游激活序列（UAS） 转录激活
GAL4效应基因
不能转录
3. 重组Domain
用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不 同的多肽连接。
蛋白B Active domain DNA binding domain 蛋白A
4. 观察报告基因表达
在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。
蛋白A
蛋白B
（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 GAL4的BD domain与AD Domain也不能靠近， 所以仍然不能启动效应基因的转录。
（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和 Gal4 系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合域由一个完整的原核蛋 白LexA 构成，转录激活域则由一个88 个氨基酸的 酸性的大肠杆菌多肽B42 构成，它在酵母中可以活 化基因的转录;
在Gal4 系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同 的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
DNA binding domain 转录激活domain 激活转录
上游激活序列（UAS）转录激活 GAL4效应基因
转录表达
双杂交原理
X基因和Y基因产物 的相互结合，导致 reporter gene表达。
Reporter gene表达就 说明X基因产物与Y 基因产物能结合。
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞
AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。 Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空 间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿 梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋 白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋 白SNF4融合。