蛋白质分离技术(全)ppt课件

（三）分离纯化的一般程序
生物大分子的分离纯化一般可分为 以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进 行细胞器的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细 分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离 纯化的前处理。
选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定
二、 蛋白质（酶） 分离纯化的前处理
（二）细胞的破碎
• 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原 来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原 来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方 法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生 物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破 碎。 • 组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的 实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。
• 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此 法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如 此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
3. 化学与生物化学方法： • 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温 度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯 酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 • 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的 稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 • 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
（一）材料的选择与预处理
• 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含 量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植 物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题， 只要能达到实验目的即可。
• 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要 除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需 要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽 可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
2.物理法： • 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后 放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞 内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 • 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和 细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 • 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小 孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
1) 盐浓度（即离子强度）：
• 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶 ，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中 性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶 现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的 静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。 • 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加 入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、 NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
（三）细胞器的分离
• 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞 还有叶绿体。 • 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了 防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需 先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 • 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在 适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次 分步离心后，即可获得所需组分。
③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要
（二）分离纯化的要求
1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作 为研究一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系 的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制 剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质 制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物 活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有 不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。
（四）提取
• 组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内
含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件 下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保 持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备 物的分解破坏，这目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； • 由固相扩散到液相的难易； • 溶剂的pH值和提取时间等。 通常：
蛋白质分离技 术 (全 )
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
（一）分离纯化的意义
①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本 质有重大意义。 ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业， 需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、 麦芽糖、糊精以及糖浆等。
极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； • • 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持 其生物活性。
2. 水溶液提取
• 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。用水溶液提取生物大分子应注 意的几个主要影响因素是： •
• 1. 机械法： • 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器 中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 • 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎 ，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式 组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎 。