分子生物学实验

一、动物总RNA的提取：

1、防止RNA酶降解的措施?

①所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。

②塑料器皿(EP管、Tris等)用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯 )12h以上，高压灭菌后备用。

③操作人员戴一次性手套，实验过程中手套要勤换。

④独立的操作空间

2、实验过程：抽提的试剂？

答：①用Trizol液分离提取；②用氯仿纯化蛋白；③异丙醇或乙醇沉淀核酸；④DEPC（焦磷酸二乙酯）是核酸酶抑制剂；⑤离心分层，RNA在上层水相，中

间是蛋白和DNA，下层是有机相；

3、实验结果图：理论上从负极到正极应该呈现3个条带，分别是28s、18s、

5s， 28s亮度是18s亮度的二倍。若点样孔处有条带，则表明有DNA、蛋白质

污染。若RNA被RNA酶降解则只有一条条带。

二、逆转录PCR（RT-PCR）

1、 RT-PCR实验原理和所用试剂及作用？

实验原理：RT-PCR较常用。在这个反应体系中，被检物为RNA，如mRNA，需借

助逆转录酶的逆转录作用，转变为相应的互补链DNA（cDNA）才能进行PCR。为此，逆转录和PCR分两步进行，先作逆转录获得cDNA，再以此为模板作PCR。2、所用试剂有RNA酶抑制剂、逆转录酶缓冲液、逆转录酶、4种dNTP、TaqDNA聚合酶、引物

三、PCR扩增

1、PCR扩增实验步骤和所用试剂及其作用

步骤：①模板变性（92℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

②低温退火（37℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

③延伸（72℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP

为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

2、所用试剂及作用：①模板DNA②TaqDNA聚合酶，③扩增缓冲液，④dNTP，

⑤引物。

四、外周血DNA的提取：

1、外周血DNA的提取原理：用外周血淋巴细胞提取，本实验中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法。基本原理就是苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，

而对DNA却没有影响。经苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相与水相完全分层，蛋白

质变性而被离心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA则留在水相。标本中的脂

类杂质溶解于酚/氯仿相，从而与水相分离得以去除。

2、实验过程中的试剂：①DNA细胞裂解液：里面的SDS是表面活性剂，主要作

用裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面。另外，Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相，减少在蛋白质层的滞留。

②蛋白酶K：细胞膜裂解以后，细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中，而蛋白酶K 具有水解蛋白质和DNA酶的作用，并且在EDTA和SDS存在的条件

下仍保持较高的活性。③苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液：在苯酚/氯仿加入少量的异戊醇，可以减少实验中气泡的产生，而且有利于分层，保持分层的稳定性。

④异丙醇：加入异丙醇可以吸收水相中的水分，使得DNA沉淀析出；⑤70%的冰乙醇：可以去除可溶性的多糖、金属离子等杂质以及残留的苯酚/氯仿等。

3、电泳图（有DNA、蛋白质污染的图、降解的图）：去掉RNA的试剂TE试剂（含RNase），去掉蛋白的试剂蛋白酶K。

五、质粒的提取：

1、原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在

上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来

2、溶液1、2、3的成分：溶液Ⅰ：葡萄糖、EDTA和溶菌酶；溶液Ⅱ： NaOH 、SDS；溶液Ⅲ：KAc-HAc的缓冲液。

3、电泳图谱：三条带，为质粒的三个构型：超螺旋、线性、开环（跑得最快的是超螺旋，以此类推）

六、琼脂糖凝胶电泳：

①DNA上样缓冲液：溴酚蓝与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成。

②核酸染料：溴化乙锭（EB），是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱

基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

③电泳方向：负极到正极。