ELISA法甲胎蛋白(AFP)的检测
两种不同方法检测甲胎蛋白的比较
两种不同方法检测甲胎蛋白的比较摘要】目的探讨研究酶联免疫吸附法(ELISA)和电化学发光分析法(ECLIA)对甲胎蛋白(AFP）检测的效果。
方法对65例血清标本同时采用ELISA 和ECLIA方法进行AFP检测，并对同一标本连续测定20次进行批内变异的比较，同时对标本每天测定1次，连续测定20天进行批间变异比较。
评价两种方法的稳定性、敏感性及重复性。
结果ECLIA其检出限为0.50μg /ml，线性范围为0.50μg /ml～ 3000μg /ml；当AFP<400μg/ ml时，ELISA和CL对AFP检测敏感性差别无统计学意义；当AFP>400μg/ ml时，ECLIA检测敏感性高于ELISA，P ＜0.05，有统计学差异；ECLIA低、中、高值批内和批间CV均小于5，较ELISA重复性好、稳定性高。
结论ECLIA敏感性高、稳定性、重复性好。
【关键词】甲胎蛋白电化学发光分析法酶联免疫吸附法【中图分类号】R446.6 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2012）13-0280-02Two different methods for the detection of alpha-fetoprotein comparison. Hu xiao-qing, The People's Hospital Laboratory of Nanxiong, Nanxiong Guangdong，512400 China.【Abstract】 Objectives Study of ELISA and ECLIA on alpha-fetoprotein( AFP ) detection effect.Methods On65 serum specimens from patients with ELISA and ECLIA methods for AFP detection, and determination of the same specimen consecutive20times within a batch variability compared to specimens were measured every day,1 times,20 days of continuous determination of interassay variation comparison. Evaluation of two methods of stability, sensitivity and reproducibility.Results ECLIA the detection limit is0.50μg / ml, linear in the range of 0.50μg / ml ～3000μg / ml; when AFP <400μg / ml, ELISA and CL on AFP detection sensitivity difference was not statistically significant; when AFP >400μg / ml, ECLIA detection sensitivity is higherthan that of ELISA, P < 0.05, with statistical difference; low, high value of ECLIA, intra and inter CV were less than 5, is ELISA good repeatability, high stability.Conclusions ECLIA high sensitivity, stability, good repeatability.【Key Words】 AFP ECLIA ELISA甲胎蛋白(Alpha fetal protein, AFP）是1956年Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种单一多聚体肽链的糖蛋白，其分子量平均为68000[1]，系肝细胞内粗面内网核糖颗粒所合成，在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白，正常成人肝细胞失去合成AFP的能力。
甲胎蛋白实验报告
一、实验目的本实验旨在通过检测血清甲胎蛋白（AFP）水平，了解甲胎蛋白在正常人群和疾病状态下的含量变化，并探讨其在临床诊断中的应用价值。
二、实验材料1. 实验试剂：甲胎蛋白检测试剂盒、标准品、质控品、血清样本等。
2. 实验仪器：全自动生化分析仪、离心机、酶标仪等。
三、实验方法1. 样本采集：采集受试者空腹静脉血5ml，置于EDTA抗凝管中，立即离心分离血清。
2. 标准曲线绘制：根据试剂盒说明书，将标准品进行稀释，配置成一系列浓度梯度，进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。
3. 实验操作：按照试剂盒说明书，将血清样本进行稀释，加入反应孔中，进行ELISA实验。
4. 结果读取：在酶标仪上读取各孔的吸光度值，以标准曲线计算出样本中的甲胎蛋白浓度。
四、实验结果1. 正常人群甲胎蛋白水平：本次实验共检测了100例正常健康人群的血清甲胎蛋白水平，结果显示，甲胎蛋白浓度为（15.2±4.8）ng/ml，均低于20ng/ml。
2. 疾病状态甲胎蛋白水平：本次实验共检测了100例疾病患者的血清甲胎蛋白水平，包括肝癌患者、肝硬化患者、生殖腺恶性肿瘤患者等。
- 肝癌患者：甲胎蛋白浓度为（1000±300）ng/ml，明显高于正常人群。
- 肝硬化患者：甲胎蛋白浓度为（50±20）ng/ml，与正常人群相比无明显差异。
- 生殖腺恶性肿瘤患者：甲胎蛋白浓度为（300±100）ng/ml，高于正常人群。
五、讨论1. 甲胎蛋白在正常人群中的含量较低，一般在20ng/ml以下。
本次实验结果显示，正常人群甲胎蛋白水平符合这一特点。
2. 甲胎蛋白在疾病状态下的含量明显升高，尤其是肝癌患者，其甲胎蛋白水平可达到正常人群的数十倍甚至上百倍。
这表明甲胎蛋白在肝癌的诊断中具有重要的临床价值。
3. 肝硬化患者和生殖腺恶性肿瘤患者的甲胎蛋白水平也高于正常人群，但升高幅度不如肝癌患者明显。
这提示甲胎蛋白在肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等疾病诊断中具有一定的辅助价值，但需结合其他检查手段进行综合判断。
SOP文件：甲胎蛋白(AFP)1
宁城县中蒙医院赤峰市精神病防治院检验科CLinLab.NCXZMYY(CFSJSBFZY)甲胎蛋白（AFP）标准操作程序编号：日期：版本：第页共页1、变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。
2、范围：测定人血清、血浆、体液中的甲胎蛋白。
3、操作程序：使用仪器：日本东曹AIA-600II型全自动化学发光免疫分析仪生产厂商名称：日本东曹株式会社注册号：国食药监械（进）字2007第2400371号3.1、测定原理:本试剂盒使用的是高亲合性抗AFP抗体，并采用一步EIA夹心法定量检测人血清和体液中的AFP含量，可用于原发性肝细胞癌、肝炎、肝硬化、怀孕后期的诊断，治疗过程中的监视以及治疗后的效果评价3.2、试剂：E-test（TOSOH）Ⅱ（AFP）免疫反应试剂3.3 操作步骤3.3.1、在试剂Cup中加入100微升缓冲液和25微升标准品或稀释后的样品溶液，在磁石磁珠振动器上搅拌，在37℃下使抗原抗体反应进行10分钟3.3.2、用洗脱液冲洗试剂Cup，除去其中游离的酶联标记抗体和样品成分（B·F分离）。
3.3.3、加入基质液后，在磁石磁珠振动器上搅拌同时用荧光检测器检测荧光物质的荧光强度，激发波长363nm，荧光吸收波长447nm，并计算出荧光物质的生成速度。
3.3.4、根据标准液检测绘制的荧光物质生成速度标准曲线，计算出样品中AFP的浓度。
3.3.5、如果检测结果超过400ng/mL时，要用样品稀释液提高稀释倍数重新稀释，并按照（1-4）步骤检测。
3.4、结果判定3.4.1、应用E-test（TOSOH）Ⅱ（AFP）标准品试剂盒绘制标准曲线，从曲线中计算出样品中AFP的浓度。
3.4.2、分析225例健康者血清中AFP浓度的检测结果，所得的参考标准范围是0.9-7.6ng/ml。
其中，参考标准范围因为很容易受其他各种因素影响，所以希望各单位自行设定。
4、注意事项：1. 本品是一种体外诊断用试剂，禁止以其他目的使用。
肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)的检测及临床意义
肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）的检测及临床意义一、概述1、甲胎蛋白（α-fetoprotein；AFP）胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种由591个氨基酸组成的糖蛋白，电泳时位于白蛋白和α1球蛋白之间。
2、新生儿时期AFP很高，到1岁时降至10µg/L～20µg/L，在成人血清中AFP的含量很低。
当肝细胞发生恶性变时，AFP含量明显升高，是临床上辅助诊断原发性肝癌的重要指标。
二、参考区间血清AFP检测的参考区间可因方法、仪器、试剂不同而有不同。
三、筛查血清 AFP 联合肝脏超声检查可作为原发性肝癌高危人群的筛查。
高危人群以乙型肝炎病毒（HBV）和（或）丙型肝炎病毒（HCV）感染者、长期酗酒者以及有原发性肝癌家族史者为主，筛查年龄男性≥ 40 岁，女性≥50 岁开始，宜每隔 6个月检查一次。
四、临床意义1、血清AFP是临床上辅助诊断原发性肝癌（简称肝癌）最常用的肿瘤标志物。
对于血清AFP≥400μg/L超过1个月，或≥200μg/L持续2个月，在排除妊娠、活动性肝病和生殖系胚胎源性肿瘤后，应高度怀疑肝癌，需做B 超检查，必要时做CT/MRI和活组织检查等以明确诊断。
血清AFP对肝癌诊断的阳性率一般为70%左右，尚有约30%的肝癌患者AFP检测阴性，因此，不能仅靠AFP来诊断肝癌。
2、血清AFP升高也可见于生殖系胚胎源性肿瘤，如睾丸非精原细胞瘤、卵黄囊瘤、恶性畸胎瘤等。
还可见于其他恶性肿瘤，如胃癌，结直肠癌等。
3、急、慢性肝炎、肝硬化患者血清中 AFP 可出现不同程度的升高，多在20～200µg/L之间，一般在2个月内随病情的好转而逐渐下降。
4、妇女妊娠3个月后血清AFP可见升高，主要来源于胎儿。
孕妇血清中AFP异常升高，可见于胎儿神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等。
AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量异常升高。
孕妇血清中AFP异常降低，提示胎儿有Down's 综合征的风险。
AFP检测——ELISA法
AFP检测——ELISA法【申请单】×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】方法电化学发光法ELISA法RIA法本次检查选择√【材料准备】1.人甲胎蛋白（AFP）ELISA定量检测试剂盒。
2.受检者血清。
3.水浴箱/37℃恒温箱。
4.加样枪。
5.酶标仪。
【操作方法】按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作流程如下：1.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2.温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。
3.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
5.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟.7.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
【结果计算】以标准品浓度（ng/ml）为横坐标，OD值（450）为纵坐标，绘制标准曲线。
根据待测样品的OD值，计算出待测样品中AFP的实际浓度。
【参考区间】1.正常人血清AFP<20ng/ml。
2.由于ELISA法受人工因素干扰大，重复性相对较差，因此在每次测量时都要加标准品做标准曲线。
【注意事项】1.标本的采集和保存血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血，避免细菌污染，血清标本宜在新鲜时检测，一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过1周测定的需低温冰存。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白是宫内妊娠期间表现为显著升高的一种细胞囊性蛋白，它可以在血液和尿液中检测出，由于其在精确诊断妊娠的期间可以起到非常重要的作用，因此检测甲胎蛋白的方法一直以来都是非常普遍的。
常用的甲胎蛋白检测方法有ELISA、流式细胞仪和放射免疫分析等，其原理主要是利用免疫反应原理，所以正确操作及评估结果是非常重要的。
(1) ELISA：ELISA即酶联免疫吸附分析，是一种检测甲胎蛋白浓度的定量检测方法。
ELISA采取比较常见的研究方法，将抗体以及检测抗原定位在固定底物（试管板）的表面上，建立其特异的抗原抗体反应环，然后用酶和酶试剂体系分析后，检测酶试剂消除后的抗原浓度。
(2) 流式细胞仪：流式细胞仪是一种能够检测微量吞噬性细胞因子，如甲胎蛋白在血液核心内的浓度的检测方法。
该检测原理基于混合抗体反应，混合到样本中的标记同抗体与细胞内抗原结合，可以显示出被检测物质在核心内的浓度。
(3) 放射免疫分析：放射免疫分析是一种采用放射性标记的抗体，检测甲胎蛋白在体内的浓度的检测方法。
该检测原理是，通过将放射性标记的抗体与抗原结合后，再将其相关的一系列试剂添加到样本中，从而定量的检测抗原在样本内的浓
度。
3种不同方法检测甲胎蛋白的比较
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ＴＲＦＩＡ，ＲＩＡ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ＲＩＡ．ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｒａａｓｓａｙ
ｒａｎｇｅ
１
１ ０００ ｎｇ／ｍｌ ｆｏｒ ＴＲＦＩＡ，５～４００ｎｇ／ｍｌ ｆｏｒ ＲＩＡ ａｉｌ（｛５～３００ｎｇ／ｍｌ ｉｎｔｅｒａｓｓａｙ ＣＶ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ ｓｅｒｕｍ
ｏ（－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ
ＣＨＥＮ Ｈａ／一ｗｅｉ。ｅｔ
ｂｙ ＴＲＦＩＡ，ＲＩＡ ａｎｄ
ａｌ
ＥＬＩＳＡ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ
ｄ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｉｎ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔａｒｙ，ｔｈｅ
２结果
２．１线性比较
将ＡＦＰ标准品（苏州新波生物技术有限公司提 供）１ ０００ｎｇ／ｍｌ按不同的浓度稀释后做线性实验。 结果显示，ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法和ＴＲＦＩＡ法分别当 ＡＦＰ浓度在５～３００ｎｇ／ｍｌ、５～４００ｎｇ／ｍｌ、１—１ ｍｌ范围内呈现良好的线性关系。 ２．２精密度试验比较 取一混合血清（ＡＦＰ含量为６２ｎｇ／ｍ１）分别用３ 种方法同时平行２０次计算批内误差；连续１０ｄ，次 ／ｄ，计算批间误差，结果见表１。 ２．３对比试验 将随机抽检的３０份病人血清标本分别用３种 方法进行检测，并对３种方法进行比较。回归方程： 设Ｙ为ＲＩＡ法所测ＡＦＰ含量，Ｘ。为ＴＲＦＩＡ法所测 ＡＦＰ含量，ｘ：为ＥＬＩＳＡ法所测ＡＦＰ含量，结果见表
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ
AFP临床应用及其检测
AFP临床应用及其检测AFP临床应用及其检测1. 简介AFP（Alpha-fetoprotein），又称甲胎蛋白，是一种在胎儿中产生的蛋白质。
AFP在正常情况下在胎儿怀孕期间被产生，然后在出生后迅速下降至低水平。
然而，在一些疾病状态和恶性肿瘤中，AFP的水平会显著升高。
因此，AFP检测在临床中被广泛应用于早期肿瘤筛查和肝癌、睾丸癌等疾病的诊断和监测。
2. AFP检测方法2.1 血清AFP测定血清AFP测定是最常用的检测方法之一。
通过血液样本中的酶免疫化学发光法（ECLIA）或免疫层析法等技术手段，测定血清中的AFP浓度。
结果可快速得出，具有简便、快速、非侵入性等优点。
2.2 妊娠前诊断在孕妇妊娠期间，AFP水平的异常变化可以用于妊娠并发症的早期筛查，如神经管缺陷等。
妊娠期AFP的检测常通过血清AFP测定或羊水中的AFP测定实现。
2.3 肝癌检测与诊断AFP的水平在肝癌患者的血清中常常升高。
因此，在高危人群中的AFP检测常用于早期肝癌的筛查和诊断。
结合其他检测指标如肝功能、超声、磁共振等，能提高肝癌的检测准确性。
2.4 睾丸癌检测与监测AFP的水平在睾丸癌患者的血清中往往升高。
AFP的检测可以用于睾丸癌的早期诊断、疗效评估和预后监测。
3. AFP检测的临床应用3.1 肿瘤筛查AFP的测定常用于肿瘤筛查，旨在早期发现和诊断肝癌、睾丸癌等恶性肿瘤。
3.2 肝癌患者的监测AFP的水平可以用于监测肝癌患者的疗效和复发情况。
通过定期检测AFP，可以及早发现疾病的进展和复发。
3.3 妊娠并发症筛查AFP的检测可以用于早期筛查妊娠期间的并发症，如神经管缺陷等。
4. 附件本文档涉及下列附件：- 附件1：AFP检测结果表格样本- 附件2：AFP测定方法详细说明5. 法律名词及注释- AFP（Alpha-fetoprotein）：甲胎蛋白的英文缩写，是一种在胎儿和少数成人中产生的蛋白质。
- ECLIA（Electrochemiluminescence Immunoassay）：酶免疫化学发光法，是一种常用于血清AFP测定的技术手段。
分子生物学实验课：酶联免疫分析检测人甲胎蛋白(AFP)n
基本原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
•①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） •②酶标记的抗原或抗体（标记物） •③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留 其免疫活性；
操作步骤
6.加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入100ul的 HRP标记的抗AFP抗体，空白调零孔除外。37℃温育35分 钟。
7.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300ul洗 涤液，静置1分钟弃去，如此重复5次，拍干。
8.显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。 轻轻震荡混匀， 37℃ 避光显色15分钟.
试剂盒组成：
1.酶联板：一块（96孔） 2.标准品 3.HRP标记的抗AFP抗体 4.TMB显色 5.浓洗涤液 6.终止液
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20 分钟左右（2000-3000转/分）。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸 钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟 左右（2000-3000转/分）。
试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内。 4.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本
中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一 孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍） 后再测定，计算时最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6.底物请避光保存。 7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定 必须以酶标仪读数为准.
然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记 物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性；
酶联免疫吸附试验测AFP——ELISA双抗体夹心法
实验材料与仪器
待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、 酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液 A、显色液B、终止液
滴管、吸管、微量加样器、移液管 酶标仪、温育箱
操作
在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原（100UL/孔）
↓37℃×30min
弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次
↓拍干
加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔
第一组：边缘效应 第二组：叠加效应 第三组：温浴方式 第四组：加样方式 第五组：洗涤次数 第六组：温浴时间 第七组：试剂温度
小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方 案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可 行性，讲述时间为2-3分钟左右。
要求设计方案中包括： 实验对象、标本要求 操作条件、操作过程（可画出96孔加样示
实验设计要求
在实验本上绘出36孔设计图表
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
写出实验中选择的包被液的情况 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、
检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 写出最终测得的OD值并分析实验结果。
评价
双抗体夹心ELISA法简单易行，不需 复杂的仪器设备，特异性强、敏感性 高，其中一步法更简单、省时，但有 Hook效应的缺点。
↓37℃×30min
弃去孔内液体，同上洗涤三次
↓拍干
加底物A、B液各2滴(100UL/孔)
↓37℃×15min
显色后加终止液1滴(50UL/孔)
↓
酶标比色仪450nm读取OD 值
棋盘滴定法选择最佳工作浓度
选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右 阴性参考血清A值<0.1
（即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴 性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标 浓度为最佳的ELISA检测浓度。）谢！
甲胎蛋白检测方法
甲胎蛋白检测方法甲胎蛋白（AFP）是一种胚胎发育早期产生的糖蛋白，主要存在于胚胎和胎儿的肝脏、消化道和生殖系统。
在正常成人中，AFP的浓度极低，但在某些情况下，如肝癌、睾丸癌、卵巢癌和胎儿开放性神经管缺陷等疾病中，AFP的浓度可能异常升高。
因此，AFP的检测被广泛用于肿瘤诊断和产前筛查。
甲胎蛋白检测一般通过血清学检测，主要有酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）和化学发光法（CLIA）等方法。
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种常用的AFP检测方法。
该方法使用特异性抗体与AFP结合形成免疫复合物，再通过底物与酶标记测定物质的结合来检测目标物质的浓度。
ELISA方法操作简单、快速、灵敏度高，并且可以同时检测多个样本，已广泛应用于临床实践中。
放射免疫测定（RIA）是另一种常用的AFP检测方法。
该方法利用同位素标记的特异性抗体与AFP结合，通过测量同位素放射性衰减来确定目标物质的浓度。
RIA方法灵敏度高、特异性好，但操作相对复杂，仪器设备要求高，并且涉及到放射性同位素的使用，对操作者的安全性要求较高。
化学发光法（CLIA）是一种新兴的AFP检测方法，利用特定的荧光信号来检测目标物质的浓度。
CLIA方法操作简单、灵敏度高、动态范围广，并且无需使用放射性同位素。
此外，CLIA方法还可以实现自动化检测，提高检测效率。
以上所提到的三种方法在AFP检测中都有各自的优缺点，具体选择使用哪种方法，应根据实际需要和实验条件来确定。
此外，不同的商业试剂盒和仪器也可能对结果产生影响，因此在进行AFP检测时，应严格按照说明书操作，并根据相关标准进行质量控制，以确保结果的准确性和可靠性。
除了血清学检测方法，还有其他一些检测AFP的方法，如尿液检测、组织切片免疫组化等。
尿液检测方法操作简便，但灵敏度相对较低；组织切片免疫组化方法可以直接观察AFP在组织中的表达情况，对于肿瘤的定量和定位有较大的帮助。
综上所述，甲胎蛋白检测方法主要包括血清学检测、尿液检测和组织切片免疫组化等方法。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白测定方法1.免疫比浊法：这是一种常见的甲胎蛋白测定方法，其基本原理是利用抗甲胎蛋白抗体与体液中的AFP结合，并通过免疫反应形成比浊溶液。
在一定条件下，通过比较反应溶液的滴度与标准质量的AFP溶液的滴度，即可计算出待测样品中的AFP浓度。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）：这种方法是在固相酶联免疫吸附试验的基础上改进的。
首先，将待测样品加入带有特异抗体的酶标板孔中，与抗体发生特异性结合。
然后，通过洗涤去除未结合的物质，并加入与甲胎蛋白结合的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。
最后，加入底物使酶催化发生显色反应，根据反应物浓度与显色强度的相关性计算出AFP的浓度。
3.免疫电泳法：免疫电泳法通过将待测样品与抗甲胎蛋白抗体混合，然后将混合物分离电泳，以检测AFP的浓度。
根据电泳后蛋白质条带的长度和强度，可以判断AFP的浓度高低。
4. Immuno-Polymerase Chain Reaction（IPCR）：这是一种新兴的甲胎蛋白测定方法。
它结合了免疫技术和聚合酶链反应（PCR）技术。
首先，通过PCR扩增样品中的AFP基因片段。
然后，采用特异性抗体结合PCR扩增产物，形成固定复合物。
最后，通过荧光素酶或放射性示踪剂对复合物进行检测，计算待测样品中AFP的浓度。
以上是目前常见的AFP测定方法，每种方法都有其优点和局限性。
选择合适的方法应根据实际需要、设备条件和诊断要求。
甲胎蛋白的测定方法对于一些疾病的早期诊断和治疗监测具有重要意义，然而，需要注意的是，单纯的AFP测定结果并不能作为其中一种疾病的确诊依据，还需要结合其他临床信息进行综合分析和判断。
甲胎蛋白(AFP)标准操作规程
甲胎蛋白（AFP）标准操作规程1.【实验目的】为了保证癌胚抗原（CEA）可测定结果的准确性，以及可靠性。
2.【职责】2.1 实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。
2.2 本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。
3.【样品类型及实验前准备】3.1 样本准备：3.1.1人血清，采集在肝素（钠或锂）的血浆或羊水样本可以在ARCHITECT AFP检测中使用。
其它抗凝血剂没有对是否适用于ARCHITECT AFP检测进行验证。
按照生产商有关血清或血浆采集管的处理指导进行。
3.1.2羊水必须在无菌的条件下，由适当的经过训练的人员，采取对胎儿以及母体安全相关的适当预防来进行采集。
明显血污的样本应该依据使用Kleihauer – Betke技术检查胎儿血液细胞的存在，和/或依据电泳，免疫电泳或其他可用技术检查胎儿血色素。
为胎儿血液污染的羊水样本可能出现异常高AFP值，这可能导致检测结果的曲解。
3.1.3血清或血浆样本应该进行无菌采集，这是一种避免溶血的方式。
对于母体血清或血浆分析，血液样本应该在羊水诊断开始前进行采集。
有证据表明，在羊水诊断后，在母体的血清或血浆中，出现了AFP的水平增加。
3.1.4如果检测时间超过24小时，则将血清或血浆从凝集物，血清分离器或红细胞中取出。
检测前，样品可以在2－8℃下最长7天时间。
如果检测用时超过7天，则将样品贮存于－20℃或更低温度下。
为了对结果进行优化，样本应该无纤维，血红细胞，或其他微粒物质。
使用前，对含有纤维，血红细胞，或其他微粒物质的样本进行离心分离，以确保结果的一致性。
3.2 患者准备：实验前正常饮食，晨起空腹，安静状态下抽取静脉血，条件特殊情况下可空腹抽血检测。
3.3 容器，添加剂类型：血清（包括在血清分离器管中采集的血清），血浆（EDTA三钾、肝素锂、肝素钠），使用玻璃管或塑料管分离样本。
ELISA测AFP试验临界值的确定
ELISA测AFP试验临界值的确定【实验原理】（孙熙奉200946603058）在微孔板上包被纯化的甲胎蛋白抗体（抗AFP），加入待测血清和酶标抗体（抗AFP-HRP），血清中的AFP与微孔板上的抗AFP 和不同量的抗AFP-HRP结合，洗涤分离后，加入酶底物系统进行显色反应。
当样品中分析物浓度处于临界值时，用定性试验重复检测，将产生50%的阳性结果和50%的阴性结果【试剂与器材】（应丽娟200946603073）试剂：已知浓度50ng/ml的AFP阳性标本、抗AFP包被的酶标板、AFP阳性对照、AFP阴性对照、抗AFP-HRP试剂、浓缩洗涤液、显色液A液、显色液B液、终止液。
器材：加样器、温箱、洗板机、酶标仪。
【试验方法】（廖婷200946603064）①实剂准备用前30分将酶标试剂盒从冰箱取出平衡至室温。
②将待测血清用生理盐水分别稀释至10ng/ml，20 ng/ml，25 ng/ml，30 ng/ml：血清10ng/ml 20ng/ml 25ng/ml 30ng/ml 阳性对照阴性对照空白对照AFP-HRP 50μL 50μL50μL 50μL 50μL 50μL50μL温育30min，37℃洗板机洗涤五次，最后一次尽量扣干加显色剂A.B各50μL 振荡混匀，避光显色 37℃，15min加终止剂50μL。
振荡混匀，在450nm的波长和630nm双波长检测，测定每个孔A值注：每稀释倍各10孔，阳性，阴性，空白对照各2孔【结果判断】：（凌凡200946603067）1阳性判定CO值计算阳性判定值=阴性对照孔A均值Nc*2.1 2阴性判定样品A值＜CO值为AFP阴性 3阳性判定样品A值≧CO值为AFP阳性 4阴、阳性结果各占50%的浓度即为临界值【结果处理】（朱洪200946603061）以浓度为横坐标，阳性率为纵坐标，找出阳性率为50%的浓度的临界值（坐标图）【质量控制】（欧洪菊200946603070）每板应设阴性对照孔2孔、阳性对照孔2孔、空白对照2孔。
afp监测方案
AFP监测方案引言AFP（Alpha-fetoprotein）是一种胎儿发育过程中产生且在出生后逐渐减少的一种蛋白质。
在正常情况下，在成人体内几乎找不到AFP的存在。
然而，AFP水平的异常升高可能表明存在一些疾病，如肝癌、睾丸癌或胃肠道肿瘤等。
因此，监测AFP的水平对于早期诊断和治疗这些疾病非常重要。
本文将介绍一个AFP监测方案，以帮助医生和研究人员进行有效的AFP监测。
AFP监测方案步骤1：患者选择在开始AFP监测之前，需要选择合适的患者群体。
通常，AFP监测适用于以下情况的患者：•高风险肝癌患者：曾经患过肝癌的患者或具有肝癌家族史的患者；•睾丸癌患者：曾经患过睾丸癌的患者或具有睾丸癌家族史的患者；•胃肠道肿瘤患者：曾经患过胃肠道肿瘤的患者或具有胃肠道肿瘤家族史的患者。
步骤2：抽取血样接下来，需要抽取患者的血样进行AFP的测量。
血样可以通过静脉采集或指尖采血的方式获取。
静脉采集可以获得更多的血样，但指尖采血对于患者来说更为方便和痛苦较小。
确保使用无菌的针头和试管来避免污染和误差。
步骤3：AFP测量获取血样后，可以使用不同的方法来测量AFP的水平。
常见的方法包括：•酶联免疫吸附测定法（ELISA）：将血样与特定的抗体结合，然后使用酶标记的二抗来检测AFP的水平。
•胶体金法：使用胶体金颗粒标记的抗体来与AFP结合，并通过观察颜色的变化来确定AFP水平。
•荧光免疫染色法：利用荧光标记的抗体与AFP结合，并使用荧光显微镜来观察和测量AFP的水平。
步骤4：数据分析和解释测量得到的AFP水平需要进行数据分析和解释。
对于每个患者，根据其风险因素和基线AFP水平，可以设置不同的阈值来确定正常范围和异常范围。
一般来说，高于设定阈值的AFP水平可能表明存在潜在的疾病风险。
医生和研究人员可以根据不同的阈值来进行进一步的诊断和治疗决策。
步骤5：定期监测一次AFP监测仅能提供特定时间点的AFP水平信息。
为了更好地了解疾病的进展和治疗效果，需要定期进行AFP监测。
人甲胎蛋白(AFP) 说明书
人甲胎蛋白（AFP）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中甲胎蛋白（AFP）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甲胎蛋白（AFP）水平。
用纯化的人甲胎蛋白（AFP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入甲胎蛋白（AFP），再与HRP标记的甲胎蛋白（AFP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的甲胎蛋白（AFP）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人甲胎蛋白（AFP）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：45μg/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
第七部分肿瘤的免疫学检测一、甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein
二、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen ,CEA）： 方法：同AFP 参考值：CEA<5µ g/L（血清） 临床意义： （1）高水平血清CEA与结肠癌密切有关； （2）有助于鉴别良性/恶性肿瘤； （3）血清CEA水平与肿瘤进展相关。
三、人绒毛膜促性腺激素（HCG） ——快速放射免疫法 方法：待测HCG+抗HCG +125I-HCG +第二 抗体 HCG-抗HCG-二抗复合物沉淀 测总 cpm值和沉淀物cpm值并计算二者比值，通过参 考标准曲线查出HCG含量 参考值：5µ g/L（2.3～13.6µ g/L）
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重， 相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
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ELISA法甲胎蛋白（AFP)的检测
发表时间：2017-08-17T15:58:40.867Z 来源：《心理医生》2017年18期作者：刘晶
[导读] 甲胎蛋白(AFP)是一种在电场中泳动于α-球蛋白区的单一多聚体肽链的糖蛋白，与血清白蛋白、维生素D结合蛋白同属一大家族。
（富裕县中医院<富裕县第二医院>检验科黑龙江齐齐哈尔 161200）
【摘要】目的：探讨ELISA法甲胎蛋白（AFP)的检测方法及意义。
方法：对原发性肝癌患者30例，对ELISA法甲胎蛋白（AFP)方法及临床意义进行分析。
结果：ELISA测得的AFP含量取不同浓度的混合血清，AFP浓度为10.7lng/mL、18.08ng/mL、46.83ng/mL，分别加入不同浓度定值血清，用ELISA法分别检测其回收率。
用ELSIA测得的回收率分别在93.90％～98.16％，平均回收率分别为96.42％，ICA的检测精度高，稳定性强。
结论：AFP是原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志，血清AFP测定结果大于500μg/L以上，或含量有不断增高者，更应高度警惕。
【关键词】ELISA法；甲胎蛋白（AFP)；检测
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）18-0058-02
甲胎蛋白(AFP)是一种在电场中泳动于α-球蛋白区的单一多聚体肽链的糖蛋白，与血清白蛋白、维生素D结合蛋白同属一大家族。
AFP是胚胎发育早期的重要血清成分，由卵黄囊和肝细胞合成。
出生后一年内降至正常水平[1]。
AFP有很强的免疫抑制功能。
当肝细胞发生病变时，AFP基因表达重新开放，于血清中可检测到AFP浓度显著升高。
1.资料与方法
1.1 实验对象
选取2015年1月-2016年6月收治的门诊或住院原发性肝癌患者30例，年龄20～79岁，平均年龄54.5±3.5岁。
所有患者增根据临床表现，经B超、CT及各项实验室指标检查确诊。
1.2 实验试剂
微孔反应板用抗AFP单抗体包被。
2～8℃干燥保存，有效期内保持稳定。
酶结合物溶于缓冲液中，含蛋白稳定剂。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
显色液A：0.05M乙酸缓冲液，含0.02%过氧化氢，存于滴瓶中。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
显色液B：含色素基质和稳定剂，存于滴瓶中。
2～8℃避光保存，有效期内保持稳定。
标准品：AFP浓度分别为5ng/ml，10ng/ml。
30ng/ml，60ng/ml，
120ng/ml，240ng/ml。
含蛋白稳定剂和防腐剂，存放于玻璃瓶中，2～8℃保存。
质控血清含AFP浓度分别为，L-I，L-Ⅱ，含防腐剂及蛋白稳定剂。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
终止液：含lN H2SO4。
洗液(10倍浓缩)：50ml，磷酸盐缓冲液，用前稀释[2]。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
1.3 方法
实验前将试剂和标本置于室温（18～28℃）平衡20分钟。
标本浓度超过200μg/L时，测定前用“0”标准品适当稀释并混匀。
建议稀释倍数为l:10，1:20，1:100。
计算数值应乘以相应稀释倍数。
将试剂盒浓缩洗液用蒸馏水稀释10倍后，充分混匀后使用。
温浴，取出所需数量的微孔，做上标记，留出一孔做空白对照（指定A1）。
在分别注明标号的反应微孔中依次加入50μl标准品0μg/L，10μg/L，30μg/L，60μg/L，120μg/L，240μg/L，质控血清，待测标本。
在每孔中加入50μl（1滴）酶结合物（除去A1）。
轻轻振荡微孔条，充分混匀。
37℃保温60分钟（注：测定高值标本时，则37℃保温30分钟）。
保温过程中保持微孔条水平。
充分倾去微孔中的液体，用洗液冲洗微孔5次。
将微孔条倒置在吸水纸上，拍尽残余水分。
显色反应，每孔加1滴（50μl）显色液A，再加1滴（50μl）显色液B。
在室温下反应5分钟。
每孔中加1滴终止液终止反应。
在终止反应的30分钟内测各孔的OD450nm。
2.结果
ELISA测得的AFP含量取不同浓度的混合血清，AFP浓度为10.7lng/mL、18.08ng/mL、46.83ng/mL，分别加入不同浓度定值血清，用ELISA法分别检测其回收率。
用ELSIA测得的回收率分别在93.90%～98.16%，平均回收率分别为96.42%。
3.讨论
所有患者的血清标本和各测试组分均按可传染情况处理，实验中的溢出物需用消毒剂彻底清除。
标本及所有可能被传染的物质均按含有传染物的情况进行净化和处理。
避免显色液B或终止液与皮肤或黏膜接触。
一旦接触，立即用水彻底清洗。
不要混淆试剂瓶盖，不要混用不同批号的试剂及微孔反应板，不要使用过期的试剂盒。
实验加样完毕后，应注意轻摇微孔反应条，一定要充分混匀[3]。
在冲洗过程中，要冲洗干净，并拍干微孔中的残余液体，否则将降低精确度，造成吸光度升高的假象。
实验完毕后，应及时将试剂盒放回，2～8℃冰箱。
使用微孔反应板应注意干燥保存，避免受潮。
贮存和使用显色液B时应避免光线直接照射。
实验过程中，实验室的温度应保持在18～28℃。
AFP是原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志，血清AFP测定结果大于500μg/L以上，或含量有不断增高者，更应高度警惕。
肝癌患者血清AFP含量变化的速率和程度与肿瘤组织分化程度高低有一定相关性，分化程度较高的肿瘤AFP含量常大于200μg/L。
AFP的动态变化与病情有一定的关系。
AFP含量上升提示病情恶化，其动态变化是显示治疗效果的一项敏感指标。
原发性肝癌患者在检测AFP时出现阴性或假阴性可能与测定方法、癌肿类型、原发部位等因素有关[4]。
肝细胞肝癌血清甲胎蛋白的水平高低与肝细胞分化程度有关，I级肝癌细胞分化接近正常细胞，故甲胎蛋白量尚不足以测出，Ⅳ级者由于分化极差，已失去类似胚胎细胞的功能，也不能从血清中检出甲胎蛋白，Ⅱ、Ⅲ级癌细胞认为是和胚胎肝细胞相似的幼稚细胞能产生甲胎蛋白，阳性率较高，由于肝细胞癌的分化程度不同，甲胎蛋白含量也有差异，是阳性率不高的原因之一。
在非肝细胞癌的胆管细胞癌等也不产生甲胎蛋白。
【参考文献】
[1]郑定容,刘仿.ELISA与ICA法对甲胎蛋白检测的比较[J]. 中国医药科学,2011,01(9):153-154.
[2]殷正丰.甲胎蛋白异质体作为肝癌标志物的临床应用[J]. 实用肿瘤杂志,2004,19(1):1-4.
[3]贾志凌,王莉,刘畅,等.甲胎蛋白异质体对肝癌诊断的临床意义[J].中国肿瘤,2010,19(10):686-688.
[4]胡敏华,陈燕,李筱莉,等.甲胎蛋白异质体的临床意义[J]. 诊断学理论与实践,2006,5(3):258-259.。