两种曲霉糖化性质的比较(实验报告)

两种曲酶糖化性质的比较研究

××××××××××在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。

黑曲霉是一种常见的真菌，属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低，只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶，现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计，25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用，例如，柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之，黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点，已愈来愈受到人们的重视。

米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。

1 材料与方法

1.1 实验材料菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4

1.2 实验培养基

种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液体深层发酵液）1.3 实验试剂

1.33%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC缓冲液；6NHCL；DNS试剂；葡萄糖标准溶液；无菌水

1.4 实验用具

水浴锅；三角瓶；试管；721型分光光度计；高压蒸汽灭菌锅；电子天平；恒温培养箱；摇床；电炉；酒精灯；吸管；量筒

1.5 实验方法

1.5.1 菌种培养

斜面菌种培养：将米曲霉和黑曲霉分别接种于土豆汁培养基和察式培养基上，于30~32℃下培养4~7天，待产生孢子后置于5℃中备用。

军种扩大培养：从斜面培养基中挑取一环孢子接种于麸皮培养基上，于30~32℃下培养，待长满孢子后备用。

1.5.2 液化酶和糖化酶的发酵生产

孢子悬浮液的制备：挑取经扩培的菌种孢子，接入内含10ml无菌水的试管中，制成孢子悬浮液，并在此基础上，继续稀释成108个/ml孢子悬液。稀释时可利用血球计数板推断选择适宜稀释度的孢子悬液。

液化酶和糖化酶的发酵:取5%孢子悬浮液接种于液体深层发酵液中，置于30~32℃，200r/min旋转式摇床上控温发酵，并定期测定酶活力，和PH。

1.5.3 酶活测定

粗酶液制备:定期取20ml发酵液经纱布过滤，1000g冷冻离心5min，取上清作为粗酶液。

液化酶活性测定；取1.5ml 1.33%可溶性淀粉于60C水浴5Min，加0.5ml酶液（或双蒸水作为空白对照），60℃反应10min，取O.1ml反应液加入10ml碘液，摇匀后680nm处测OD。每个样品作两个重复。

糖化酶（葡萄糖淀粉酶）活性测定；0.1ml1.33%可溶性淀粉加0.1ml酶液（或双蒸水作为空白对照）60℃水浴反应20min，立即加入1mlDNS试剂，沸水浴5MIN后冷却，加入4.8ml水，在520nm处测定OD值。

1.5.4 发酵液中还原糖含量的测定

葡萄糖标准曲线的制作(取9支25*25试管，分别按下表加入试剂):

项目0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准溶液（ML）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（ML） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4

DNS试剂（ML） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

将各管溶液混匀均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每官加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测OD值。以葡萄糖MG数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

项目

空白还原糖

0 1 2 3

发酵液溶液（mL）0 1.0 1.0 1.0

蒸馏水（mL） 2 1.0 1.0 1.0

DNS试剂（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5

加入试剂后，其余操作均于制作标准曲线时相同，测定后，取样品的OD值在标准曲线上查相应的糖量，用下式计算出发酵液中还原糖的含量。

还原糖浓度（mg/ml）=（还原糖mg数*稀释倍数）/ 发酵液体积

1.5.5 发酵液PH测定

定期取发发酵液用酸度计测其PH。

2 实验结果

2.1 酶活测定

发酵

时间（h）

液化酶糖化酶

米曲霉黑曲霉米曲霉黑曲霉

24 9.22 9. 18 0.85 0.67

48 9.53 9.74 0.90 0.70

72 15.43 9.80 0.96 0.94

96 9.65 9.60 3.51 3.23

表1.1 酶活力（U）的变化

从表中数据可以看出，米曲霉具有远比黑曲霉高的液化酶活性，而糖化酶活性测定中发现，米曲霉具有比黑曲霉略高的活性。

2.2 发酵液中还原糖含量测定及pH变化