IPTG诱导蛋白表达全面介绍
iptg诱导原理
iptg诱导原理
IPTG诱导原理是细胞内的反应调节机制，通过人工添加异构体，诱导基因表达。
IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）是一种
人工合成的分子，与天然存在于大肠杆菌中的半乳糖苷相似。
IPTG能够结合细胞内的反应调节蛋白，即乳糖操作子（lac operon），并激活基因表达。
在正常情况下，lac operon保持关闭状态，导致下游基因不被
转录和翻译。
这是因为乳糖操作子的反应调节蛋白（lac repressor）结合到lac operon的操作子区域上，阻止RNA聚合酶与DNA结合，从而抑制基因表达。
当添加IPTG时，它与lac repressor结合，并改变了lac repressor的构象。
这使得lac repressor无法再结合到lac operon
的操作子区域上。
因此，RNA聚合酶和其他转录因子能够结
合到操作子区域上，启动RNA的合成。
这导致下游基因的表达。
通过控制IPTG的浓度和处理时间，可以调节基因表达的强度。
较低浓度的IPTG可以产生较低水平的基因表达，而较高浓度
的IPTG可以产生较高水平的基因表达。
这使得科学家能够根
据需要来调控表达的基因，并研究其功能和作用机制。
总之，IPTG诱导原理通过改变操作子区域的可用性，从而调
节了基因的表达水平。
这为基因表达研究提供了一种有效的工具，并在生物技术和基因工程中具有广泛的应用。
IPTG诱导蛋白表达的原理及实验步骤
活性蛋白整体方案IPTG诱导蛋白表达的原理及实验步骤摘要：在原核蛋白表达体系中，如E.coli（大肠埃希菌）系统，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，本文详细讲述了常用诱导剂IPTG对外源蛋白诱导表达的原理以及实验步骤。
原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子（元），也称基因表达的协同单位(a coordinated unit of gene expression)。
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylas e)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lac repres sor)不属于乳糖操纵子。
乳糖操纵子结构基因Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。
在没有乳糖存在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。
而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
活性蛋白整体方案IPTG诱导表达原理图实验方法材料LB（Luria—Bertani）培养基酵母膏(Yeast extract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%蒸馏水(Distilled water)1000ml pH7.0IPTG贮备液2g IPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存凝胶电泳加样缓冲液50mmol/L Tris-CI(pH6.8)50mmol/L DTT2%SDS（电泳级）0.1％溴酚蓝10％甘油实验方案1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；2)按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；3)分别挑取单菌落接种于5mL LB(0.1g·L-1氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；4)以2%体积比转接于2ml LB(0.1g·L-1氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期，加0.1活性蛋白整体方案mmol/L IPTG2µl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照；5)取上述菌液1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀；6)重悬于冰的100µl PBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导的外源蛋白表达
1. 课题起源：
试验环节：
接种 扩大培养 IPTG诱导 提取、纯化
蛋白
思索：
IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）旳作用原理？
2. IPTG旳作用原理
IPTG (isopropylthiog- alactoside,异丙基硫代 半乳糖苷): 化学合成旳乳糖类似物，很强旳β －半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lac operon)旳开放，本身不被催化分解。类似旳 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种 人工化学合成旳半乳糖苷，可被β－半乳糖苷 酶水解产生兰色化合物，所以能够用作 β－半 乳糖苷酶活性旳指示剂。IPTG和X-gal都被广 泛应用在分子生物学和基因工程旳工作中。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）旳正调控
不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控 作用旳操纵子，CAP则是对转录起正性作用旳 调控蛋白──激活蛋白，编码CRP旳基因也是 一种调控基因，但是它并不在lac操纵元旳附 近，CAP能够对几种操纵元都起作用。
从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元 （inducible operon），此类操纵元一般是关 闭旳，当受效应物作用后诱导开放转录。此类 操纵元使细菌能适应环境旳变化，最有效地利 用环境能提供旳能源底物。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）旳负调控
在这过程中乳糖（实际起作用旳是 别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去 阻遏作用（derepression），诱导了利 用乳糖旳酶类基因转录开放
2.3 乳糖操纵元（lac operon）旳正调控
细菌中旳cAMP含量与葡萄糖旳分解 代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产 生能量时，cAMP生成少而分解多， cAMP含量低；相反，当环境中无葡 萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。
IPTG诱导蛋白表达的原理
I P T G诱导蛋白表达的原理IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】I P T G诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG引诱蛋白表达的道理之杨若古兰创作IPTG引诱的产品是重组后表达载体中的拔出序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列.用乳糖把持子作为启动子进行蛋白质表达的时候,须要引诱物进行引诱(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基βD硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的类似性也能够将基因表达启动,但它不克不及被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种引诱外源基因表达的引诱剂，它不但仅如我们学过的作为乳糖的类似物引诱大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍利用的引诱剂，能引诱菌种表达多种外源基因.但是它能引诱基因表达的具体道理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴.最早利用于的表达零碎是Lac乳糖把持子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产品结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这类可引诱的转录调控成为了大肠杆菌表达零碎载体构建的经常使用元件.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优胜.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp 更高的转录效力和受lacI 隔绝蛋白调控的强启动子特性.在惯例的大肠杆菌中，lacI隔绝蛋白表达量不高，仅能满足细胞本身的lac把持子，没法敷衍多拷贝的质粒的需求，导致非引诱条件下较高的本底表达，为了让表达零碎严谨调控产品表达，能过量表达lacI隔绝蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达零碎的表达菌株.此刻的Lac/Tac/trc 载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI隔绝蛋白实现严谨的引诱调控.IPTG 广泛用于引诱表达零碎，但是IPTG有必定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白其实分歧适，因此也有效乳糖代替IPTG作为引诱物的研讨.另外一种研讨方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下按捺转录，42度开发.热引诱不必添加外来的引诱物，成本低，但是因为发酵过程中加热升温比较慢而影响引诱后果，而且热引诱本人会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产品波动.T7启动子是当今大肠杆菌表达零碎的主流，这个功能强大兼专注性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，特别以Novagen公司的pET零碎为杰出代表 .强大的T7启动子完整专注受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本人基因的转录竞争不过T7表达零碎，几乎所有的细胞资本都用于表达目的蛋白；引诱表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上.因为大肠杆菌本人不含T7 RNA 聚合酶，须要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因此T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7零碎的调控模式——非引诱条件下，可以使目的基因完整处于沉默状态而不转录，从而防止目的基因毒性对宿主细胞和质粒波动性的影响；通过控制引诱条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产品表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分. 有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达零碎.1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI按捺基因和位于lacUV5启动子下的 T7 RNA 聚合酶基因.DE3溶源化的菌株如 BL21(DE3)就是最经常使用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，引诱调控方式和lac一样都是IPTG引诱.2.另一种计谋是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完整防止因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而形成的质粒不波动.然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR 启动子控制T7 RNA 聚合酶的衍生株，在热引诱条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成.此了噬菌体以外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶.比方有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制.因为T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平.2.是采取带有T7lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下流有一段lacI把持子序列编码表达lac 隔绝蛋白(lacI)，lac 隔绝蛋白可以感化于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并按捺其表达，也感化于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录.pLacI工转化也是同样的道理.如果这还不敷，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并按捺T7 RNA 聚合酶的基因——T7融菌酶，降低本底.经常使用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE 会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，添加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平.通过几种分歧方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达零碎.生物通在上面首进步前辈行主流表达零碎介绍：了解各种产品的特色，是选择合适的表达零碎的关键哦 .在网上查的这些，回答的不是十分清楚，又不爱去查文献，所以想请问一下各位博友的高见.。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是 trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI 阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的 lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
IPTG诱导蛋白表达的原理
.诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，IPTG 并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
需要诱导物进行诱,用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候-D-异丙基-β相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG((导但它基因表达启动,硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将.,从而实现持续的表达不能被细胞利用掉是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作IPTG它是一种普遍应用的为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
我在网上查但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，到以下一些内容，供查阅者借鉴。
可IPTGLac乳糖操纵子，乳糖的类似物最早应用于的表达系统是. ，从而激活转录lacI产物结合，使其构象改变离开lacO以和达系统载体构建的常这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表的拼接杂合启动子，且转trp启动子和lacUV5用元件。
tac启动子是启动lac子是启动trp启动子和更优越。
录水平更高，比lacUV5trc 阻遏蛋白更高的转录效率和受同样具有比trplacI 子的拼合启动子，阻遏蛋白表达量lacI 大肠杆菌中，调控的强启动子特性。
在常规的不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为1 /.上通常还Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
lacI带有lacIq 基因，以表达更多有人认为在IPTG有一定毒性，IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是为IPTG作制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替30lacI 的温度敏感突变体，诱导物的研究。
另外一种研究方向是用成本低，物，度下抑制转录，42度开发。
7.29IPTG诱导蛋白表达
7.29IPTG诱导蛋白表达
IPTG诱导蛋白表达
1.将两个工程菌的种子液取1ml转接至50ml的离心管中，37度揺菌2到3小时，至OD 值为0.6，每个菌做3个重复。
2.将转接后的两种菌液IPTG诱导表达，分别设置3个浓度梯度，GLCNASE(周质空间表达蛋白）的浓度梯度分别为0.01mM（每10ml 菌液加1M的IPTG0.1μL),0.05mM(每10ml菌液加1M的IPTG0.5μL),0.1mM(每10ml菌液加1M的IPTG1μL)。
GLCNACASE （胞内表达蛋白）的浓度梯度分别为0.1 mM(每10ml菌液加1M的IPTG1μL),0.5mM(每10ml菌液加1M的IPTG5μL),1mM(每10ml菌液加1M的IPTG10μL).
3.每管加10mlLB培养基和10μl浓度为100mg/ml的AMP,使混合溶液的终浓度为
100μg/ml.GLCNACASE在30度揺菌4小时，6小时，8小时分别取样，GLCNASE分别揺菌2小时4小时6小时分别取样保存。
4.配制SDS_PAGE蛋白电泳用胶，存放在4度冰箱备用。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
iptg诱导蛋白表达的最佳条件
IPTG诱导蛋白表达是实验室常用的一种方法，能够在原核细胞中诱导外源蛋白的表达。
通过IPTG诱导，可以控制外源蛋白的表达水平，并且能够在一定程度上避免细胞毒性。
下面我们来探讨一下IPTG诱导蛋白表达的最佳条件。
一、IPTG诱导蛋白表达的基本原理在大肠杆菌等原核细胞中，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）能够与lac操作子结合，从而激活lac重子基因，使得beta-半乳糖苷酶（β-galactosidase）表达升高。
而在真核细胞中，IPTG则不会起到任何作用。
IPTG在诱导原核细胞中的外源蛋白表达方面有着重要的应用价值。
二、IPTG诱导蛋白表达的影响因素1. IPTG浓度：IPTG浓度对蛋白表达水平有着直接的影响。
一般来说，较低的IPTG浓度能够减少蛋白表达对宿主细胞的负担，而较高的IPTG浓度则能够更快速地诱导蛋白表达。
2. 细胞培养温度：细胞的培养温度也会影响IPTG诱导蛋白表达的效果。
通常情况下，在37摄氏度下培养的细胞更容易被IPTG诱导，但在一些特殊情况下，低温培养也可以获得更高的蛋白表达水平。
3. 细胞培养时间：细胞在接受IPTG诱导后需要一定时间来表达目标蛋白。
合理的培养时间是保证蛋白表达效果的关键因素之一。
4. 细胞品系：不同的细胞品系对IPTG的敏感程度有所不同，选择合适的细胞品系也是影响蛋白表达效果的重要因素。
三、最佳的IPTG诱导条件1. IPTG浓度：一般情况下，我们可以在0.1-1mM的浓度范围内进行试验，以观察最佳的蛋白表达效果。
通常来说，0.1mM的IPTG浓度已经能够较好地诱导蛋白表达，而1mM的IPTG则能够更快速地达到最高表达水平。
2. 细胞培养温度：大多数情况下，将菌液在37摄氏度下培养12-16小时，然后经过IPTG诱导，再以28摄氏度温育4-6小时能够获得较好的蛋白表达效果。
3. 细胞培养时间：根据实验需要，通常在IPTG诱导后持续培养4-6小时，即可得到最佳蛋白表达效果。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导蛋白表达的原理
诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，IPTG 并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
需要诱导物进行诱,用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候-D异丙基-B相当于点火），但乳糖可以被细胞利用掉，所以利用IPTG（导但它基因表达启动,硫代半乳糖苷）在结构上与乳糖的相似性也可以将. ,从而实现持续的表达不能被细胞利用掉是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作IPTG 它是一种普遍应用的为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
我在网上查但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，到以下一些内容，供查阅者借鉴。
可IPTGLac 乳糖操纵子，乳糖的类似物最早应用于的表达系统是. ，从而激活转录lacI 产物结合，使其构象改变离开lacO 以和达系统载体构建的常这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表的拼接杂合启动子，且转trp启动子和lacUV5用元件。
tac启动子是启动lac子是启动trp启动子和更优越。
录水平更高，比lacUV5trc 阻遏蛋白更高的转录效率和受同样具有比trplacI 子的拼合启动子，阻遏蛋白表达量lacI 大肠杆菌中，调控的强启动子特性。
在常规的不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI 阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为 1 / 上通常还Lac/Tac/trc 表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc 载体阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
lacI 带有lacIq 基因，以表达更多有人认为在IPTG 有一定毒性，IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是为IPTG 作制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替30lacI 的温度敏感突变体，诱导物的研究。
另外一种研究方向是用成本低，物，度下抑制转录，42 度开发。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理之宇文皓月创作IPTG诱导的产品是重组后表达载体中的拔出序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖把持子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基βD硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不克不及被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不但仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖把持子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产品结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的经常使用元件。
tac启动子是 trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在惯例的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac把持子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产品表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的 lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白其实分歧适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用 lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。
然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
优点：1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物。
由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。
2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。
由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。
不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。
乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。
3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。
4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β–半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。
注意事项：培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 μl/3 ml(24 mg/ml)。
含有IPTG 的培养基4℃避光保存，须在1~2 周内使用。
保存：2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。
远离热源及氧化剂。
IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法摘要: E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac 操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 .在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态.此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动.当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导.在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身.乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖.后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用.材料：1、诱导表达材料：( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基：酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃保存.( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS (电泳级)0.1 % 溴酚蓝10 % 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料：1 )酶溶法(1)裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF ).(3)10 mg / mL 溶菌酶.(4)脱氧胆酸.(5)1 mg / mL DNase I.2 )超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液.( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 % 溴酚蓝20 % 甘油实验方案：1、外源基因的诱导表达：(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因.( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌.( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,确定无误后进行下一步.( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L.继续培养3 -5h .( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测.2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：4 ℃,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL ).弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀.试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载体。
我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后是送去测序。
所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。
之后就是转化BL21表达菌株中。
转到BL21表达菌株时间大概是15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是这时候出现的。
以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。
1、诱导与提取目的蛋白①菌种活化。
重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单菌落，分别接种于25mL LB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，180r/min，过夜振荡培养。
②菌种扩培。
取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。
③融合蛋白的诱导表达。
向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、4、5、6h）。
④目的蛋白的提取。
A. 经诱导后取1mL菌液，4℃12000g，10min收集菌体;吸出菌液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的菌体复悬，4℃12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。
超声处理为7min，超3s，停10s，功率为75w。
超声波处理后，样品4℃12000g，10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL样品进行SDS-PAGE电泳检测。
图片即为SDS胶跑完后的状态。
我的蛋白预测应该是在40kDa左右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。
反而在30kDa处出现奇怪的条带...做了几次都是这样的状态。
同实验室的也有人在做这一步，她的蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。
还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不到原因，难道这个也是可以传染的？去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，但是按照他说的方法重新试了也不行。
难道是因为驯化时间太久所以BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株中确实有我们的质粒。