IPTG诱导的外源蛋白表达分析
iptg诱导原理
iptg诱导原理
IPTG诱导原理
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是一种结构类似于乳糖的化合物，常用于诱导细菌中外源基因的表达。
在诸多实验中，IPTG一直是实现诱导的常用试剂。
IPTG的诱导原理主要基于大肠杆菌（E. coli）中的lactose （乳糖）代谢途径。
在正常情况下，大肠杆菌利用lactose的降解途径来使细胞内的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）进行活性调控。
在大肠杆菌中，当培养基中的乳糖耗尽时，细菌会通过在培养基中积累的cAMP（环腺苷酸）来激活AMP依赖性蛋白激酶（AMP-dependent protein kinase）。
该激酶会磷酸化培养基中的cAMP受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP），进而使CRP蛋白能够与细菌基因组上的lac操作子（lac operator）结合。
lac操作子是位于大肠杆菌lacZ基因附近的一个特定DNA区域，其能够阻止β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的表达。
当CRP 蛋白与lac操作子结合后，它会诱导DNA环境的改变，从而阻止附近的lacZ基因的表达。
IPTG的作用在于模拟乳糖对细菌的作用。
IPTG和乳糖具有相似的化学结构，可以结合到CRP蛋白上，形成IPTG-CRP复合物。
这个复合物在结构上类似乳糖-CRP复合物，能够与lac 操作子结合，从而使CRP蛋白离开lac操作子，达到诱导lacZ
基因表达的效果。
综上所述，IPTG能够通过模拟乳糖对大肠杆菌的作用，诱导β-半乳糖苷酶的表达。
通过适当的浓度和处理时间，研究人员可以控制IPTG的使用来实现外源基因在大肠杆菌中的高效表达。
IPTG诱导蛋白表达全面介绍
IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。
然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
《IPTG诱导原理》课件
IPTG和IPTG解析过程
IPTG 与 LacI 酶结合后从而迫使 其解离 DNA，打开感受体，促进 表达。
应用
1
IPTG在对pET表达系统的优化中的
2
应用
结合 pET 表达系统，IPTG 能够诱导外源
作用
在 Lac 操作子系统中，IPTG 作为抑制剂与诱导剂的功能， 能够作用于负责在 DNA 上 切割单糖的酶（LacI）上， 破坏拉曼氏单元系统，诱导 蛋白表达。
原理
Lac内部 负责分解半乳糖的代谢系统，也 是 IPTG 诱导的重要前提条件。
IPTG 的结构与性质
总结
IPTG在生物学领域中的价值
IPTG 作为一种常用诱导剂，已经成为生物学研究中极其重要的工具。
作用及其应用前景
IPTG 在各个研究领域，如生物医学、工业制剂等，有着极大的应用潜力，成为了近年热门 的研究方向。
参考文献
• IPTG-诱导外泌表达蛋白的工具 • IPTG引发的蛋白表达
蛋白在包含 T7 转录子的载体中高效表达，
具有重要意义。
3
IPTG在高效表达外源蛋白中的应 用
IPTG 作为一种非天然诱导物，其使用能 提高蛋白表达的效率，广泛应用于各种 生物技术的领域，如蛋白纯化、药物制 剂等。
IPTG的缺点及其他诱导物较之优 点
IPTG 可导致胞内工艺费用增加、胞毒性 增强等副作用，其他诱导物如 arabinose、 ribose 等也有广泛应用。
IPTG诱导原理
这份 PPT 课件将向大家介绍 IPTG 的定义，IPTG 诱导的原理以及其在生物学 领域中的应用。
IPTG诱导的外源蛋白表达
1. 课题起源：
试验环节：
接种 扩大培养 IPTG诱导 提取、纯化
蛋白
思索：
IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）旳作用原理？
2. IPTG旳作用原理
IPTG (isopropylthiog- alactoside,异丙基硫代 半乳糖苷): 化学合成旳乳糖类似物，很强旳β －半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lac operon)旳开放，本身不被催化分解。类似旳 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种 人工化学合成旳半乳糖苷，可被β－半乳糖苷 酶水解产生兰色化合物，所以能够用作 β－半 乳糖苷酶活性旳指示剂。IPTG和X-gal都被广 泛应用在分子生物学和基因工程旳工作中。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）旳正调控
不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控 作用旳操纵子，CAP则是对转录起正性作用旳 调控蛋白──激活蛋白，编码CRP旳基因也是 一种调控基因，但是它并不在lac操纵元旳附 近，CAP能够对几种操纵元都起作用。
从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元 （inducible operon），此类操纵元一般是关 闭旳，当受效应物作用后诱导开放转录。此类 操纵元使细菌能适应环境旳变化，最有效地利 用环境能提供旳能源底物。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）旳负调控
在这过程中乳糖（实际起作用旳是 别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去 阻遏作用（derepression），诱导了利 用乳糖旳酶类基因转录开放
2.3 乳糖操纵元（lac operon）旳正调控
细菌中旳cAMP含量与葡萄糖旳分解 代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产 生能量时，cAMP生成少而分解多， cAMP含量低；相反，当环境中无葡 萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。
IPTG诱导蛋白表达的原理
I P T G诱导蛋白表达的原理IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】I P T G诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
实验五 用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白
实验五用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白一、目的要求1.学习和掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达的原理和实验技术；2.观察大肠杆菌在诱导过程中的形态。
二、原理pET 系统是有史以来在E.coli 中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET 质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定 (详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和 pI 启动子控制的T7 RNA 聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7 启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
三、试剂与器材试剂：LB培养基、IPTG、氨苄青霉素、草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。
器材：摇床、显微镜等。
四、操作步骤A、诱导许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。
IPTG诱导蛋白表达原理
诱导剂(inducer): 别乳糖、半乳糖、 诱导剂(inducer): 别乳糖、半乳糖、 IPTG（异丙基硫代半乳糖苷） IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）
The Lac Operon:
When Glucose Is Present But Not Lactose
Hey man, I’m ’ constitutive CAP Come on, let me through
诱导和阻遏表达
诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激 诱导（ ）：在特定的环境信号刺激下， ）： 刺激下 表达产物增加。 从而使基因的表达产物增加 这类基因称为可诱导基因。 活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 (induction)。 。 乳糖 → 利用乳糖的三种酶表达 阻遏（ ）：在 刺激下， 阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制， ）： 特定环境信号刺激下 相应基因被抑制， 从而使基因的表达产物减少 这类基因称为可阻遏基因。 表达产物减少。 从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 (repression）。 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 ）。
操纵子（ 功能相关的 操纵子（operon)：很多功能相关的结构基因串联排列在染色体 ：很多功能相关 结构基因串联排列在染色体
上，由一个共同的控制区来操纵这些基因的表达，包含这些结构基 由一个共同的控制区来操纵这些基因的表达， 共同的控制区来操纵这些基因的表达 因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。 因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理内部编号：(YUUT・TBBY・MMUT・URRUY・UOOY・DBUYI・0128)I P T G 诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候，需要诱导物进行诱导（相当于点火），但乳糖可以被细胞利用掉，所以利用IPTG（异丙基-B -D-硫代半乳糖昔）在结构上与乳糖的相似性也可以将启动，但它不能被细胞利用掉，从而实现持续的表达. IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖昔酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供査阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lad产物结合，使其构象改变离开lacO,从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacl阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacl阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacl阻遏蛋白的laclq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有laclq基因，以表达更多lacl阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
IPTG作为基因诱导剂的优点
IPTG作为基因诱导剂的优点
1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子,称为安慰诱导物（gratuitous inducer）。
由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。
2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量（1mmol/L)即可达到理想诱导效果。
由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。
不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。
乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。
4.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送。
5.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β-半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。
IPTG的简介
1.结构
几种诱导重组目的蛋白表达诱导剂
1.IPTG
IPTG 是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂。
IPTG诱导表达步骤
大肠杆菌中蛋白质诱导表达
(一)材料
1. IPTG(用去离子水配成1 00mM，用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存)
2. 10xPBS缓冲液: NaCl 1.37 M
KCl 27 mM
Na2HPO4 100 mM
KH2PO420 mM
3. PMSF(用异丙醇配成10mM，-20℃保存)
4. 10% TritonX-100
(二)方法
1. 挑取单克隆接种于少量含有抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm震荡培养过夜;
2. 将过夜培养物按1:100的比例接种到新鲜的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,
250rpm震荡培养2-4h至OD600为0.5;
3. 加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续37℃, 250rpm震荡培养2-3h;
4. 4℃, 4000rpm离心10min后，去上清，加入适量IxPBS重悬，在加入PMSF至终浓度为
0.1 mM，冰上预冷10min;
5. 进行冰浴超声破碎5-10min (10-20sec/次)，至菌液较为澄清;
6. 加入10% TritonX-100至终浓度为0.5%, 4 ℃震荡15min;
7. 4℃, 12000rpm离心10min后，取上清:
8. 用相同体积的1 xPBS重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清
和沉淀分别进行蛋白电泳检测，考马斯亮蓝染色，脱色:
9. 根据脱色结果，可确定是否表达出目的蛋白，并且判断所表达的蛋白是可溶性还是以包
涵体形式存在。
IPTG诱导对蛋白表达的影响
界各地都有污染 食品的报道.大量的食物 中都有
产物 .为进 步研 究 L MO分 子生物学 特性 ,李 氏杆
李氏杆菌的存在 ,牛奶和奶制品通常和李斯特杆
菌的爆发有关 ,其中,软奶 酪制 品是污染最多的 .
所 以 ,对 L MO的研 究在 公共 卫 生上具 有 重要 意 义 .
菌病 的发病机理 ,李氏杆菌的检测提供必要条件.
文章编号
10 — 39 2 0 ) 2 0 9 — 3 0596 ( 60— 90 0 1
IT P G诱导浓度 对重组 李 氏溶血素 表达 的影 响
邹运 明,马 武龙 ,高慎 阳,任艳红 ,李 一经
( 东北农业大学动物医学学院, 黑龙 江 哈尔滨 10 3 5 0 0)
摘 要 :单核 增生性李斯特杆 菌(.ooy gns的主要 毒力基 因 h Lm nct ee) o l y与融合表 达载体 p E 一 P 1 G X 6 一 相连 ,转
12 抗体 .
一
利用它来逃离宿主吞噬空泡 .单核增生性李斯特 菌被吞噬泡吞噬( 内化 ) ,通过 L O在乔噬泡膜 后 L
上 打孔 而 导致 大 量铁 离 子 和 其他 大 分 子 物质 流 出 .
抗 F本实验室利用单核增生性李氏杆菌活菌 } 1
膜被 溶 解后 ,细菌 进 入胞 浆 内. 因此 ,L O在 L
在 ,报 道 的从 每 升 的 培 养 基 中获 得 的 纯 化 的 L O L
m 公司 ,异丙基硫代半乳糖苷(P G) a IT 购于 T K R a aa 公司 .硝酸纤维 素膜 ( C膜 ) N ,Whta M 滤纸 a n3 m
购 自美 国 P l公 司. al 1 方法 . 4
L MO的 致病 过 程 中起 着 决 定 性 作 用 .L O 可 以从 L
IPTG诱导蛋白表达的原理
.诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，IPTG 并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
需要诱导物进行诱,用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候-D-异丙基-β相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG((导但它基因表达启动,硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将.,从而实现持续的表达不能被细胞利用掉是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作IPTG它是一种普遍应用的为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
我在网上查但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，到以下一些内容，供查阅者借鉴。
可IPTGLac乳糖操纵子，乳糖的类似物最早应用于的表达系统是. ，从而激活转录lacI产物结合，使其构象改变离开lacO以和达系统载体构建的常这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表的拼接杂合启动子，且转trp启动子和lacUV5用元件。
tac启动子是启动lac子是启动trp启动子和更优越。
录水平更高，比lacUV5trc 阻遏蛋白更高的转录效率和受同样具有比trplacI 子的拼合启动子，阻遏蛋白表达量lacI 大肠杆菌中，调控的强启动子特性。
在常规的不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为1 /.上通常还Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
lacI带有lacIq 基因，以表达更多有人认为在IPTG有一定毒性，IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是为IPTG作制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替30lacI 的温度敏感突变体，诱导物的研究。
另外一种研究方向是用成本低，物，度下抑制转录，42度开发。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
iptg原理
iptg原理IPTG原理。
IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）是一种常用的诱导剂，常用于诱导外源基因的表达。
它的原理是通过模拟内源诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，从而激活外源基因的表达。
在分子生物学研究中，IPTG的使用非常普遍，下面我们来详细了解一下IPTG的原理。
IPTG是一种结构类似于乳糖的化合物，可以与乳糖酶结合，从而激活其催化作用。
乳糖酶是一种常见的蛋白质，它在大肠杆菌中起着分解乳糖的作用。
当外源基因被植入大肠杆菌中，我们希望通过诱导剂来激活这些外源基因的表达，从而产生我们需要的蛋白质。
而IPTG就是可以模拟乳糖的作用，与乳糖酶结合，从而激活外源基因的表达。
在实验中，我们通常会将外源基因植入表达载体中，然后将这个表达载体转化到大肠杆菌中。
接下来，我们需要添加IPTG来诱导这些外源基因的表达。
当IPTG进入细胞内时，它会与乳糖酶结合，从而改变其构象，使其能够结合到外源基因的启动子区域，激活外源基因的转录和翻译过程，最终产生我们需要的蛋白质。
需要注意的是，IPTG只是一种诱导剂，它并不参与蛋白质的合成过程，而是通过激活外源基因的表达来实现蛋白质的产生。
在实验中，我们通常会根据需要来调整IPTG的浓度和诱导时间，以达到最佳的表达效果。
除了诱导外源基因的表达，IPTG还常用于蛋白质纯化过程中。
在一些情况下，我们需要大量产生某种蛋白质，然后通过纯化过程来获取纯净的蛋白质样品。
在这个过程中，IPTG同样可以被用来诱导外源基因的表达，从而产生大量的目标蛋白质。
总的来说，IPTG是一种常用的诱导剂，通过模拟乳糖的作用来激活外源基因的表达。
在分子生物学研究和蛋白质纯化过程中，IPTG发挥着重要的作用，为科研工作者提供了便利。
希望通过本文的介绍，您能对IPTG的原理有更深入的了解。
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【实验目的】熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。
【实验原理】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)在E.coli BL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。
当培养基中存在IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。
(基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268 )本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)。
pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwiniauredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I 位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。
crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35kDa。
【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.实验仪器细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装) 2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸3．实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coli BL21(DE3)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1．将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coli BL21(DE3)，涂布在含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基平板上，37℃，培养至菌落清楚。
iptg诱导蛋白表达的最佳条件
IPTG诱导蛋白表达是实验室常用的一种方法，能够在原核细胞中诱导外源蛋白的表达。
通过IPTG诱导，可以控制外源蛋白的表达水平，并且能够在一定程度上避免细胞毒性。
下面我们来探讨一下IPTG诱导蛋白表达的最佳条件。
一、IPTG诱导蛋白表达的基本原理在大肠杆菌等原核细胞中，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）能够与lac操作子结合，从而激活lac重子基因，使得beta-半乳糖苷酶（β-galactosidase）表达升高。
而在真核细胞中，IPTG则不会起到任何作用。
IPTG在诱导原核细胞中的外源蛋白表达方面有着重要的应用价值。
二、IPTG诱导蛋白表达的影响因素1. IPTG浓度：IPTG浓度对蛋白表达水平有着直接的影响。
一般来说，较低的IPTG浓度能够减少蛋白表达对宿主细胞的负担，而较高的IPTG浓度则能够更快速地诱导蛋白表达。
2. 细胞培养温度：细胞的培养温度也会影响IPTG诱导蛋白表达的效果。
通常情况下，在37摄氏度下培养的细胞更容易被IPTG诱导，但在一些特殊情况下，低温培养也可以获得更高的蛋白表达水平。
3. 细胞培养时间：细胞在接受IPTG诱导后需要一定时间来表达目标蛋白。
合理的培养时间是保证蛋白表达效果的关键因素之一。
4. 细胞品系：不同的细胞品系对IPTG的敏感程度有所不同，选择合适的细胞品系也是影响蛋白表达效果的重要因素。
三、最佳的IPTG诱导条件1. IPTG浓度：一般情况下，我们可以在0.1-1mM的浓度范围内进行试验，以观察最佳的蛋白表达效果。
通常来说，0.1mM的IPTG浓度已经能够较好地诱导蛋白表达，而1mM的IPTG则能够更快速地达到最高表达水平。
2. 细胞培养温度：大多数情况下，将菌液在37摄氏度下培养12-16小时，然后经过IPTG诱导，再以28摄氏度温育4-6小时能够获得较好的蛋白表达效果。
3. 细胞培养时间：根据实验需要，通常在IPTG诱导后持续培养4-6小时，即可得到最佳蛋白表达效果。
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2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
操纵子（o）序列位于启动子（p）与被 调控的基因之间，部分序列与启动子序列 重叠。 在乳糖操纵元中，调控基因lac I位于Plac 邻近，有其自身的启动子和终止子，转录 方向和结构基因群的转录方向一致，编码 产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。
2. IPTG的作用原理
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使 乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactose permease) 和催化乳糖分解第一步的β －半乳糖苷酶(β galactosidase)。 在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠 杆菌合成β-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖或其 类似物2-3分钟后，细菌大量合成β -半乳糖苷 酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一 碳源时，菌体内的β-半乳糖苷酶量可占到细菌 总蛋白量的3%。
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
乳糖操纵元含有ｚ、ｙ和ａ3个结构基因。 ｚ基因表达产物为β -半乳糖苷酶，催化乳 糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为 半乳糖和葡萄糖；ｙ基因编码半乳糖透过 酶，促使环境中的乳糖进入细菌；ａ基因 编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化 半乳糖的乙酰化。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生 去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌 很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录 活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。 lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需 要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌 是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖 而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
ｚ基因5’侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位
点（ribosome binding site，RBS）特征的 Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元 开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA 上。
2.1 乳糖操纵元（lac operon）
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
vector information
MCS region
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
IPTG诱导的表达载体必须以过表达lac阻遏物 的大肠杆菌为宿主，才能阻止外源基因在诱导 前的转录。由于大多数IPTG诱导的表达质粒 拷贝数很高（30~600），因此需要过量阻遏 物才能阻断基础表达（渗漏表达）。单拷贝的 q lac I 等位基因可以表达过量10倍的lac阻遏物 但是，如果外源蛋白对宿主的毒性非常强，或 q 者质粒拷贝数非常高，就需要将lac I 等位基因 克隆进表达质粒，确保紧密调节。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
细菌中有一种能与cAMP特异结合的 cAMP受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），当CRP未与cAMP结合时它 是没有活性的，当cAMP浓度升高时， CRP与cAMP结合并发生空间构象的变 化而活化，称为CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方 式与特定的DNA序列结合。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
在这过程中乳糖（实际起作用的是 别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去 阻遏作用（derepression），诱导了利 用乳糖的酶类基因转录开放
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解 代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产 生能量时，cAMP生成少而分解多， cAMP含量低；相反，当环境中无葡 萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。
由于ｚ、ｙ、ａ三个基因头尾相接，上一个基 因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码， 因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子 （polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上 一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下 来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的 蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的 蛋白质。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
运用乳糖操纵元控制外源蛋白表达的 目的：
在需要菌体大量繁殖时，为了提供更 多的物质和能量确保菌体正常快速的生 长，需要将外源基因关闭。 菌体浓度达到要求时，可通过诱导使 菌体表达大量外源蛋白。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
在我们所使用的PGEX载体中，插入了乳糖 操纵元的调控基因lac Iq和启动子Plac ，其后 紧接GST基因、外源基因。 这些基因头尾相接，上一个基因的翻译终止 码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一 个核糖体能沿此转录生成的多顺反子mRNA 移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白 质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA 移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依 次合成这基因群所编码所有的蛋白质。
3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用
IPTG诱导的条件：
一般：0.5mM 28℃ 3.5hours 通过调节温度和IPTG的浓度，诱导表达质粒慢
转导，防止外源蛋白表达过快而形成包涵体。 影响大肠杆菌中获得高表达水平的重要因素 可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是 表达外源蛋白的关键。 表达量低 高温诱导 易形成包涵体 低温诱导
IPTG诱导的蛋白表达调控
1. 课题来源：
实验步骤： 接种 扩大培养 IPTG诱导 蛋白 提取、纯化 思考： IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？
2. IPTG的作用原理
IPTG (isopropylthiog- alactoside,异丙基硫代 半乳糖苷): 化学合成的乳糖类似物，很强的β －半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lac operon)的开放，自身不被催化分解。类似的 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种 人工化学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷的指示剂。IPTG和X-gal都被广 泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时， lac操纵元处于阻遏状态。此ｉ基因在其 自身的启动子Pi控制下，低水平、组成 性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅 维持约10个分子的阻遏蛋白。 R以四聚体形式与操纵子ｏ结合，阻碍 了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止 了基因的转录起动，从而阻遏了这群基 因的表达。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段序 列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异 结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强 RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50 倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时， cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac 操纵元的结构基因表达下降。
2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控
不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控 作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的 调控蛋白──激活蛋白，编码CRP的基因也是 一个调控基因，不过它并不在lac操纵元的附 近，CAP可以对几个操纵元都起作用。 从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元 （inducible operon），这类操纵元通常是关 闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类 操纵元使细菌能适应环境的变化，最有效地利 用环境能提供的能源底物。
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控
当环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷 酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R 的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与 操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻 遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利 用乳糖的酶类，β－半乳糖苷酶在细胞内的含 量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的 诱导作用。