目的蛋白的诱导表达
诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响_百替生物
诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响_百替生物诱导剂对工程菌表达重组目的蛋白的影响摘要：观察诱导剂对工程菌发酵及重组目的蛋白表达的影响，从而选取最佳诱导表达条件。
本文主要阐述了几种诱导剂对工程菌发酵菌体密度以及重组目的蛋白表达量的影响，分析了不同诱导剂诱导表达重组蛋白的特点及存在的问题。
同时着重介绍了阿拉伯糖做为诱导剂对重组目的蛋白表达量的影响，研究得到工程菌发酵的最优条件，为阿拉伯糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。
关键词：IPTG;乳糖；阿拉伯糖；诱导；发酵近年来，重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术。
采用高密度发酵技术，提高菌体的发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率，不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取，还可以缩短生产周期、降低生产成本，从而极大地提高在市场上的竞争力。
然而在研究高效发酵过程中，人们往往会遇到表达效率难以得到最大限度的提高与产率较低等问题。
在众多影响因素中，诱导剂对于外源基因高效、稳定的表达起着非常重要的作用。
由于Lac启动子是使用最早、研究最详细的启动子之一，所以目前用于诱导重组蛋白表达的诱导剂主要是IPTG和乳糖，而对阿拉伯糖诱导重组蛋白表达的研究尚少。
但有文献报道,Lac启动子的控制很不严密,在无诱导剂IPTG 的情况下可有较高的表达。
而阿拉伯糖(Ara)启动子是一个控制较严密且具较高表达水平的启动子将得到普遍应用。
1、操纵子类型及调控类型原核生物基因表达调控主要发生在转录水平上，转录调控的基本单元是操纵子。
1.1操纵子的概念根据操纵子学说，很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。
包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。
1.2乳糖操纵子——可诱导负调控乳糖操纵子的结构：由启动子（P）、操纵基因（O）、调节基因、结构基因所组成。
操纵基因I编码一个可扩散的分子,引起基因的阻遏。
2 大肠杆菌中诱导表达目的蛋白步骤
大肠杆菌中诱导表达目的蛋白步骤1. 接种20 μL的工程菌于10 mL含抗生素的液体LB培养基中，37 ℃225 rpm 条件下培养10 h。
2. 以0.4% 的比例接种培养的细菌至含抗生素的液体LB培养基中（500 mL加2 mL），37℃250 rpm条件下培养2.5 h。
3. 降温至16 ℃，再培养0.5 h。
4. 加IPTG至终浓度0.2 M，16 ℃200 rpm条件下诱导20 h。
5. 8000 g离心5 min收集细菌。
6. 加入20 mL的缓冲液重悬细菌。
7. 8000 g离心5 min收集细菌，-80 ℃冰箱中保存。
裂解工程菌1. 从-80 ℃冰箱中取出冻存的工程菌，融化。
2. 加入17 mL 的缓冲液和2 mL甘油重悬细菌。
3. 加入1mL的Triton X-100（20 %），加DNase（1000:1），加蛋白酶抑制剂。
4. 超声裂解细菌，超声1 s，间歇1 s，直至菌液变澄清。
5. 离心分离可溶性部分（14000 g，40 min）。
6. 过滤可溶性部分（0.22 μm滤膜）。
7. 超滤管浓缩样品（定角转子最大可用离心力5000 g，最多装12 mL样品，超滤管的MWCO至少是目的蛋白的二分之一，可离心15-60 min，可达150-300 μL，可达20 mg/mL，保质期3年）。
（超滤管一旦湿了就不要再干，）硫酸铵沉淀1. 10%的硫酸铵沉淀杂蛋白：在20 mL蛋白溶液中加入1.12 g硫酸铵颗粒（颗粒越小越好），用搅拌器4 ℃搅拌8 h（先搅拌，后加硫酸铵，防止硫酸铵局部浓度过高）。
2. 5000 g离心20 min，取上清。
3. 每20 mL加硫酸铵1.14 g，搅拌过夜（10 h）。
4. 可见明显的蛋白析出（白色混浊），5000 g离心20 min，倒掉上清。
5. 加30 mL缓冲液溶解目的蛋白。
6. 3 h后，加80 mL缓冲液溶解。
7. 3 h后，10000 g离心20 min，取上清。
IPTG诱导蛋白表达全面介绍
IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。
它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。
IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。
使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。
然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。
配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
蛋白质的诱导表达及检测
加热变性蛋白样品 加入Running Buffer(Tris cl,甘氨酸)
蛋白质的检测 SDS-PAGE
目的蛋白的检测
考马斯亮蓝染色法 免疫印迹法
蛋白质的检测 免疫印迹法
基于抗体可与目的蛋白特异性结合的原理.
转移 染色 封闭 加 一抗 加二抗 洗膜 检测
洗膜
蛋白质的检测 SDS-PAGE SDS-PAGE (变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳)
是将分子筛效应和电荷效应结合在一起的 一种具有高分辨率的电泳方法.
蛋白质的检测 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ➢连续的凝胶电泳 ➢不连续的凝胶电泳源自蛋白质的检测 SDS-PAGE
➢不连续的凝胶电泳 上层胶(浓缩胶)
蛋白质的诱导表达及检测
刘娜 2004-06-10
➢蛋白质的检测 ➢蛋白质的诱导表达
蛋白质的检测
Western blot（蛋白质印迹）
首先将蛋白质用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小 分开，在将蛋白质转移到NC膜上，膜上蛋白质的位置可以保持在 与胶相对应的原位上。然后，以蛋白质的抗体为探针，对目的蛋 白质进行定性或半定量分析。
蛋白质样品的制备sdspage转移染色目的蛋白的检测细胞或组织的裂解细菌的裂解蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备细菌的裂解2xsds凝胶加样缓冲液100mmolltrisclph68200mmolldtt4sds02溴酚蓝20甘油sdspagesdspage变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳是将分子筛效应和电荷效应结合在一起的一种具有高分辨率的电泳方法
蛋白质的检测
蛋白质样品的制备 SDS-PAGE 转移 染色
目的蛋白的检测
蛋白质的检测
蛋白质样品的制备
➢细胞或组织的裂解 ➢细菌的裂解
IPTG诱导蛋白表达的原理
I P T G诱导蛋白表达的原理IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】I P T G诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
实验 蛋白质的诱导表达
一般融合载体图解
阅读框架的保证
原核表达使用的宿主菌
一般可使用的菌株有： JM109, BL21(DE3), Y1090等。
本实验使用的菌株为：BL21(DE3溶原菌) 噬菌体DE3 : 21抗性区,
LacI基因, LacUV5启动子 T7 RNA聚合酶基因
T7 RNA聚合酶:提高T7启动子启动 的蛋白质的表达水平
稀有密码Biblioteka :多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E.Coli很少 使用, 当异源目的基因的mRNA过表达时, tRNA 的数量直接 反应密码子的偏倚性, 一个或多个tRNA的稀有或缺少会导 致翻译的停止
毒性基因和质粒稳定性:
氨苄青霉素的使用 补充葡萄糖
提高表达水平的措施
提高翻译水平： 调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增 加mRNA稳定性 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。 提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代 谢负荷、恢复天然构象）
蛋白表达系统操作流程
主要步骤
制备表达载体
操作
1. 酶切, 去磷酸化
2. 胶回收纯化
制备目的DNA 1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切 3. 胶回收纯化 将目的DNA 克隆到载体上 1. 目的片断与载体连接
2. 转化非表达型宿主菌
3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒 提取酶,测序确定阅读框
转化表达宿主菌
实验
蛋白质的诱导表达
背景知识介绍
基因工程的最终目的：外源基因的高效 表达，获得有重要价值的蛋白质产品 蛋白质的表达是指为获取大量的目标蛋 白而进行的有目的性的蛋白质合成 需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其 他载体，然后导入活细胞。 包括外源基因的克隆、转录、翻译、加 工、分离纯化
蛋白表达纯化试验步骤
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽, 要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、R T-PCR,KO［酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5z感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株, 挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3) 、Rosetta gami(DE3) 、Bl21 codon(DE3) 等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0。
=左右，加入IPTG,浓度梯度从25卩M到1m 37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用卩m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽, 不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件 21)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。
9、如有上清表达, 则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种的活性而异, 也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm 摇至OD=左右（约~3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
gal1诱导下游蛋白表达的原理
gal1诱导下游蛋白表达的原理一、概述在生物学研究中，蛋白表达是一项非常重要的技术，能够为基因功能研究、药物研发等领域提供强大的支持。
在蛋白表达的过程中，常常需要使用到特定的诱导系统来调控靶蛋白的表达，其中gal1诱导系统就是其中一种常用的诱导系统。
本文将重点介绍gal1诱导下游蛋白表达的原理。
二、gal1诱导系统的概述gal1诱导系统是一种在酿酒酵母中常用的诱导系统，它能够通过外源添加的诱导剂来控制目标蛋白的表达。
在gal1诱导系统中，以D-半乳糖（D-galactose）为诱导剂，当D-galactose存在时，其会与gal4诱导子结合，进而激活下游的转录起始因子，从而促使下游蛋白的表达。
三、gal1诱导下游蛋白表达的原理1. 诱导剂D-galactose与诱导子gal4的结合在gal1诱导系统中，D-galactose是一种重要的诱导剂，其主要通过与诱导子gal4结合来实现对下游蛋白的诱导表达。
当D-galactose存在时，其能够迅速与gal4诱导子结合，形成gal4-D-galactose复合物，并进入细胞核。
2. 转录起始因子的激活在细胞核内，gal4-D-galactose复合物能够与转录起始因子相互作用，激活转录启动子，从而启动下游靶蛋白基因的转录过程。
转录启动子的激活能够促使mRNA的合成，进而带动下游蛋白的翻译与表达。
3. 下游蛋白的表达经过诱导剂D-galactose与诱导子gal4的结合以及转录起始因子的激活，下游蛋白基因得以转录与翻译，最终实现了目标蛋白的表达。
通过调控D-galactose的浓度，可以精准地控制下游蛋白的表达水平，使得gal1诱导系统成为诱导蛋白表达的重要工具。
四、gal1诱导系统的优势与应用1. 优势gal1诱导系统具有快速、高效、可控的特点，能够在较短的时间内，使下游蛋白迅速表达。
通过调节D-galactose的浓度，可以在一定范围内精准地控制目标蛋白的表达水平。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理内部编号：(YUUT・TBBY・MMUT・URRUY・UOOY・DBUYI・0128)I P T G 诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候，需要诱导物进行诱导（相当于点火），但乳糖可以被细胞利用掉，所以利用IPTG（异丙基-B -D-硫代半乳糖昔）在结构上与乳糖的相似性也可以将启动，但它不能被细胞利用掉，从而实现持续的表达. IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖昔酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供査阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lad产物结合，使其构象改变离开lacO,从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacl阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacl阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacl阻遏蛋白的laclq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有laclq基因，以表达更多lacl阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20℃ 保存。
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
原核表达目的蛋白的方法
原核表达目的蛋白的方法原核表达目的蛋白的方法1. 引言原核表达是一种常用的表达蛋白质的方法，其主要基于原核细胞（如大肠杆菌）的天然表达系统。
通过使用不同的表达载体和相关技术，研究人员可以将目的蛋白质在原核细胞中高效表达，并借此进行产量大、成本低的蛋白质生产。
2. 选择合适的表达载体在原核表达中，选择合适的表达载体是非常重要的。
常见的表达载体有质粒和噬菌体。
质粒表达系统依赖于质粒DNA在细胞内的复制和转录作用，噬菌体表达系统则是通过感染细胞引起的溶菌作用来释放表达产物。
根据需求和实验目的，可以选择适当的表达载体。
3. 选择适当的表达宿主常用的原核表达宿主是大肠杆菌，因其具有较强的表达能力和简单的培养条件。
其他一些菌株如酵母、双歧杆菌等也可以用于原核表达。
根据目的蛋白的特性和表达要求，选择合适的表达宿主。
4. 优化基因序列在进行原核表达之前，需要对目的蛋白的基因序列进行优化。
合成较高优化的核酸序列，包括优化翻译起始子和优化密码子使用。
这样可以提高蛋白质的表达水平和折叠状态。
5. 转化目的蛋白质转化是指将目的蛋白质基因导入表达宿主中的过程。
最常用的方法是通过化学转化或电转化将表达载体导入细胞。
还可以利用病毒、质粒导弹等方法进行转化，具体选择方法取决于实验需求和表达系统。
6. 诱导表达转化后，需要选择适当的诱导方法来激活表达载体中的目的蛋白基因。
常用的诱导剂有异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、丝氨酸酶等。
根据表达宿主和表达载体的不同，可选择不同的诱导浓度和诱导时间。
7. 提取和纯化目的蛋白经过表达和诱导后，目的蛋白质可在细胞内或细胞外表达。
具体提取和纯化方法可以根据蛋白质的特性和需求选择，常用的方法包括离心法、柱层析法、亲和层析法等。
8. 评估表达蛋白质的性质和功能通过一系列生化、免疫学、生物学等实验方法，可以对表达蛋白质的性质和功能进行评估。
可以利用SDS-PAGE检测蛋白质的表达水平和相对分子质量。
IPTG诱导蛋白表达的原理
.诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，IPTG 并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
需要诱导物进行诱,用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候-D-异丙基-β相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG((导但它基因表达启动,硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将.,从而实现持续的表达不能被细胞利用掉是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作IPTG它是一种普遍应用的为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
我在网上查但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，到以下一些内容，供查阅者借鉴。
可IPTGLac乳糖操纵子，乳糖的类似物最早应用于的表达系统是. ，从而激活转录lacI产物结合，使其构象改变离开lacO以和达系统载体构建的常这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表的拼接杂合启动子，且转trp启动子和lacUV5用元件。
tac启动子是启动lac子是启动trp启动子和更优越。
录水平更高，比lacUV5trc 阻遏蛋白更高的转录效率和受同样具有比trplacI 子的拼合启动子，阻遏蛋白表达量lacI 大肠杆菌中，调控的强启动子特性。
在常规的不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为1 /.上通常还Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
lacI带有lacIq 基因，以表达更多有人认为在IPTG有一定毒性，IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是为IPTG作制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替30lacI 的温度敏感突变体，诱导物的研究。
另外一种研究方向是用成本低，物，度下抑制转录，42度开发。
诱导纯化蛋白实验报告
一、实验名称：诱导纯化蛋白实验二、实验目的：1. 掌握蛋白质的诱导表达方法；2. 学习蛋白质的纯化技术；3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。
三、实验原理：蛋白质的诱导表达是指在合适的诱导剂作用下，使蛋白质在细胞内大量合成。
本实验采用IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）作为诱导剂，诱导表达目的蛋白。
蛋白质的纯化主要包括亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法。
本实验采用亲和纯化法，利用目的蛋白与特定配体的特异性结合，实现蛋白质的纯化。
蛋白质纯度的鉴定主要通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western Blot（蛋白质印迹）等方法。
四、实验材料与仪器：1. 材料：（1）大肠杆菌菌株：表达载体pET-28a+；（2）IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）；（3）诱导剂；（4）蛋白质纯化柱；（5）SDS-PAGE试剂；（6）Western Blot试剂；（7）其他试剂。
2. 仪器：（1）电泳仪；（2）凝胶成像系统；（3）Western Blot成像系统；（4）离心机；（5）恒温水浴锅；（6）其他实验仪器。
五、实验步骤：1. 转化：将pET-28a+表达载体转化到大肠杆菌菌株中，筛选阳性克隆。
2. 培养与诱导：将阳性克隆接种到LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜。
按1:100的比例将过夜培养物接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养至OD600=0.6时，加入IPTG诱导表达目的蛋白。
3. 收集细胞：诱导表达6小时后，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
4. 蛋白质裂解：将细胞重悬于裂解缓冲液中，冰浴30分钟，超声破碎细胞。
5. 亲和纯化：将裂解液上样到蛋白质纯化柱，收集流出液和结合液。
用洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，收集洗脱液。
6. SDS-PAGE：取适量洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白的纯度。
7. Western Blot：将SDS-PAGE电泳后的凝胶进行转膜，用一抗和二抗进行Western Blot检测，观察目的蛋白的表达。
IPTG诱导蛋白表达原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定.T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。
IPTG诱导蛋白表达的原理
IPTG诱导蛋白表达的原理IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂，它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶，它是一种普遍应用的诱导剂，能诱导菌种表达多种外源基因。
但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多，我在网上查到以下一些内容，供查阅者借鉴。
最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
tac启动子是 trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在常规的大肠杆菌中，lacI 阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的 lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多 lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。
另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。
蛋白质诱导表达及检测
蛋白质的检测
蛋白质样品的制备 SDS-PAGE 转移 染色
目的蛋白的检测
蛋白质的检测
蛋白质样品的制备
细胞或组织的裂解 细菌的裂解
蛋白质的检测
蛋白质样品的制备
细菌的裂解
2xSDS凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris.cl (PH 6.8) 200mmol/L DTT 4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20%甘油
浓度 PH 2%-6% 6.8
下层胶(分离胶) 5%-20% 8.8
蛋白质的检测 SDS-PAGE
凝胶的配制
30%聚丙烯酰胺(29:1的丙烯酰胺:双丙胶缓冲液(Tris cl PH 6.8) 10%过硫酸铵 TEMED H20
蛋白质的检测 SDS-PAGE
蛋白质的诱导表达及检测
刘娜 2004-06-10
蛋白质的检测 蛋白质的诱导表达
蛋白质的检测
Western blot（蛋白质印迹）
首先将蛋白质用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小 分开，在将蛋白质转移到NC膜上，膜上蛋白质的位置可以保持在 与胶相对应的原位上。然后，以蛋白质的抗体为探针，对目的蛋 白质进行定性或半定量分析。
蛋白质的检测 SDS-PAGE SDS-PAGE (变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳)
是将分子筛效应和电荷效应结合在一起的 一种具有高分辨率的电泳方法.
蛋白质的检测 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续的凝胶电泳 不连续的凝胶电泳
蛋白质的检测 SDS-PAGE
不连续的凝胶电泳 上层胶(浓缩胶)
样品的电泳
加热变性蛋白样品 加入Running Buffer(Tris cl,甘氨酸)
蛋白质的检测 SDS-PAGE
目的蛋白的检测
两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第9期，第4136-4144页研究报告Research Report两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较邱淑彬1,2荆韧威3郭正隆3谢晓东1,2*1天津农学院农学与资源环境学院,天津,300384;2天津市作物抗逆的机理及遗传改良国际联合研究中心,天津,300384;3天津医科大学基础医学研究中心,天津-牛津基因治疗联合实验室,天津,300070*通信作者,*************.cn摘要为了比较两种不同的原核表达载体体外表达纯化CP05-GFP蛋白的能力，本研究通过构建pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)、pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)、pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)三个原核表达质粒，诱导表达并纯化带有不同标签的CP05-GFP蛋白。
通过考马斯亮蓝染色技术比较两种不同的原核表达载体表达以及体外纯化CP05-GFP蛋白的能力，发现3个原核表达载体均能诱导表达出CP05-GFP蛋白，且能纯化出CP05-GFP蛋白，但是不同标签纯化CP05-GFP蛋白的纯化效率是不同的：pET28b-CP05-GFP (双His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白，但其表达量低易纯化；pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白，其表达量高但不易纯化；pGEX-6p-1-CP05-GFP (GST-Tag)原核表达系统可表达出足量的CP05-GFP(GST-Tag)蛋白，并且易纯化。
本研究有助于选择合适的载体进行融合蛋白的表达和纯化。
关键词原核表达,载体构建,蛋白纯化Comparison of Two Different Prokaryotic Expression Vectors in Protein Expression and PurificationQiu Shubin1,2Jing Renwei3Guo Zhenglong3Xie Xiaodong1,2*1College of Agronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384;2Tianjin Joint Research Center for Crop Stress Resistant and Genetic Improvement,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384;3Tianjin-Oxford Joint Laboratory Gene Therapy,Research Cen-ter of Basic Medical Science,Tianjin Medical University,Tianjin,300070*Corresponding author,*************.cnDOI:10.13417/j.gab.039.004136Abstract To compare the ability of two different prokaryotic expression vectors in the expression and purification of CP05-GFP in vitro,the pET28b-CP05-GFP(Double His-Tag),pET28b-CP05-GFP(Single His-Tag) and pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)expression vectors were constructed.Afterwards,the CP05-GFP proteins with different tags were expressed and purified.The expression efficiency of these two vectors and the ability of different tags to purify the CP05-GFP proteins were compared by coomassie blue staining.The CP05-GFP proteins with different Tags could be obtained from the pET28b-CP05-GFP(Double His-Tag),pET28b-CP05-GFP(single His-Tag)and pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)expression vectors.While the abilities of different tags to purify to purify CP05-GFP in vitro were compared by Coomassie blue staining technique.The results showed that the CP05-GFP protein with double His-Tag was expressed in a low level,but easy to be purified.In contrast,the CP05-GFP protein with a single His-Tag could be expressed with high abundance but difficult to be purified. Significantly,the CP05-GFP with a GST-Tag could be expressed with high abundance and easy to be purified.基金项目：本研究由国家自然科学基金(31771858)资助引用格式：Qiu S.B.,Jing R.W.,Guo Z.L.,and Xie X.D.,2020,Comparison of two different prokaryotic expression vectors in protein expression and purification,Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue(Genomics and Applied Biology),39(9):4136-4144(邱淑彬,荆韧威,郭正隆,谢晓东,2020,两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较,基因组学与应用生物学,39(9):4136-4144)体外重组蛋白表达技术已经渗透到生物学的各个领域。
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目的蛋白的诱导表达
1.诱导目的蛋白表达
（1）从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2）将过夜培养的重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞分别按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。
（3）37℃摇床培养至OD600到0.4-1。
（4）从重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞中各取10ml培养物作为未诱导对照；在剩下的样品中加入1M IPTG储液至终浓度1mM，继续培养2-3
小时。
（5）将摇瓶置于冰上5分钟，5000g 4℃离心15分钟收集菌体，菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析等。
2.表达条件的优化：
1）IPTG的诱导浓度的确定：
（1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，
37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2）将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。
（3）在37℃，250rmp摇床培养至OD600约为0.8。
（4）按6ml/份上述培养物分装，分别加入IPTG至终浓度0, 0.5, 1, 1.5, 2.0mM。
（5）37℃，250rmp摇床培养8h，在无菌条件下取样并测定OD600值。
（6）所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。
（7）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。
2）IPTG诱导温度条件的优化：
（1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，
37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2）将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。
（3）在37℃，250rmp摇床培养至OD600约为0.8。
（4）在诱导之前，将30ml培养液分为5份，每份各6ml，其中4份加入IPTG，另1份不加IPTG作为不诱导对照。
加入IPTG至终浓度为1.0mM,选取几个适当温度点（可从15-37℃之间选择）250rmp摇床培养。
（5）培养8h后，在无菌条件下取出样品6ml，并测定OD600值。
（6）所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。
（7）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。
3）诱导时间优化
（1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，
37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2）将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于80 ml Amp(100ug/ml)+LB培养液中。
（3）在37℃，250rmp摇床培养至OD600约为0.8。
（4）在诱导之前，取出6ml不加IPTG作为不诱导对照。
剩余加入IPTG至终浓度为1.0mM,在37℃250rmp摇床培养。
（5）每1小时在无菌条件下取样6ml并测定OD600值，取样后剩余培养物继续培养。
（6）所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。
（7）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。
4）诱导培养物的光密度优化：
（1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2）将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于70 ml Amp(100ug/ml)+LB培养液中。
（3）在37℃，250rmp摇床培养至OD600为0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0时分别取样10ml/份。
（4）各自加入IPTG至终浓度1.0mM.
（5）37℃，250rmp摇床培养8h，在无菌条件下取样并测定OD600值。
（6）所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。
（7）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。
5) SDS-PAGE加样量的确定：
在诱导后收集细胞前，充分摇荡使上清液均匀，在诱导和未诱导的培养液中各取出0.5-1.0ml。
尽量准确的确定OD600值。
可以通过用相同的培养基进行稀释（通常为1:5到1:10稀释）使OD600读数在0.1-0.8之间。
在工作表中记录稀释
3.大量表达：
（1）重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2）取过夜培养物，按照1%接种至200ml培养基中，在1L培养瓶中，在优化温度下，250rmp摇床培养至OD600约为0.5-1.0。
建议OD600为0.6，约
2-3小时）。
（3）以预实验确定的优化条件诱导目的蛋白的表达。
（4）5000g 4℃离心15分钟收集菌体。
如果需要，收集上清液进行进一步分析。
（5）菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。
4.表达形式的鉴定：
（1）将冻存的菌体沉淀用1χPBS（pH7.8）洗涤2-3次，除净培养基。
（2）每100ml培养物的沉淀重悬与4ml的1χBinding Buffer(pH7.9)中。
（3）加入溶菌酶使终浓度为1mg/ml，冰上放置30min。
（替代方法：用超声波裂解诱导表达的菌体，功率300W超声30s，间歇30s，工作30次，注意冰上操作。
）
（4）混合物于4℃摇床上孵育10min。
加入Triton-100，DNase和RNase,至终浓度为1%，5ug/ml和5ug/ml。
再于4℃摇床上孵育10min。
（5） 4℃，3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片，上清转入新管备用。
（6）取50ul上述上清50hl 2χSDS上样缓冲液，沉淀加入100ul 1χSDS上样缓冲液,煮沸15min变性，0℃储存备用，用于SDS-PAGE分析。
5.SDS-PAGE分析
（1）制备10%分离胶7.5ml，5%的浓缩胶3ml,封板，灌胶。
（2）样品加入适量的1χSDS上样缓冲液，混匀，煮沸，0℃储存备用。
依据菌液OD600值确定电泳上样量（一般应<20ul）
（3）电泳：采用8V/CM的电压跑浓缩胶，采用15V/CM的电压跑分离胶，至考马斯亮蓝到达凝胶底部时停止电泳。
（4）染色及脱色：凝胶置于至少5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液中，室温于摇床上染色，再置于脱色液中，平缓摇动脱色4-8h，期间更换脱色液3-4次。
UVP扫描分析电泳结果，计算目的蛋白条带的相对含量。
拍照，凝胶可保存于20%甘油的水中。
6.菌液总蛋白含量的测定：
Lowry法测定重组蛋白的浓度：
以1号管为空白，在650nm波长比色，测定各管吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，做出标准曲线。
（2）样品的测定
取待测样品溶液1ml，操作及所加试剂与标准曲线制作条件相同（最好与标准
曲线制作同时进行），测定待测样品溶液吸光度，查标准曲线，求得的蛋白质含量，再乘以稀释倍数，即得待测样品的蛋白质含量。
若无标准曲线，也可用“三管法”测定未知的蛋白质的含量：取三支试管，其中一支为空白管，加入1ml双蒸水，标准管和测定管分别加入1ml已知蛋白浓度的样品溶液（或标准蛋白溶液）和1ml待测样品，然后加入其他试剂，按上述条件操作，最后，以空白管调零，于650nm波长比色，分别读取标准管和测定管
的吸光度值A标和A测，按下面公式计算：
C样=（A标/A测）*C标。