第三章 抗体制备
3 章 抗体制备(免疫学)
四、佐 剂
佐剂（adjuvant）： ） 佐剂 同抗原一起或预先注射于机体， 同抗原一起或预先注射于机体，能够增强机 体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 佐剂：可有免疫原性，也可无免疫原性。 佐剂：可有免疫原性，也可无免疫原性。 颗粒性抗原是否用佐剂？ 颗粒性抗原是否用佐剂？
三、人工抗原的制备 人工抗原的制备
(一)人工结合抗原： 一 人工结合抗原 人工结合抗原： 指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原， 后具有免疫原性的半抗原 指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原， 例如多糖、多肽、甾体激素等。 例如多糖、多肽、甾体激素等。 用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。 用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。
(3)冻融法 (3)冻融法 原理：因突然冷冻， 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶 剂浓度的突然改变而破坏细胞。 剂浓度的突然改变而破坏细胞。 •方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结， 方法 融化，如此反复两次， 融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的 颗粒可被融破。 颗粒可被融破。
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（二）可溶性免疫原的提纯 可溶性免疫原的提纯 1．超速离心法 2．选择性沉淀法 利用各种蛋白质分子理化特性的差异， 利用各种蛋白质分子理化特性的差异， 采用不同的沉淀剂或改变某些条件、 采用不同的沉淀剂或改变某些条件、促使某 一蛋白质成分沉淀。 一蛋白质成分沉淀。
常用选择性沉淀法: 常用选择性沉淀法: 选择性沉淀法 1）盐析法 最常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。 最常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。 33% 饱和度的硫酸铵 简便易行， 纯度不高，只适用于初步纯化。 简便易行，但纯度不高，只适用于初步纯化。
抗体制备原理
抗体制备原理抗体是一种特异性蛋白质，能够识别并结合到其特定的抗原上。
抗体的制备原理是通过免疫原性物质刺激机体产生特异性抗体，或者通过体外培养细胞（如淋巴细胞、骨髓细胞等）制备。
抗体制备的过程中，需要经历抗原的选择、免疫原的制备、动物免疫、抗体的纯化等步骤。
首先，抗体的制备需要选择合适的抗原。
抗原是能够诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、糖类、核酸等。
在选择抗原时，需要考虑其免疫原性、稳定性和纯度等因素。
通常情况下，选择具有较强免疫原性的抗原能够更好地诱导机体产生高效的抗体。
其次，制备抗体需要进行免疫原的制备。
免疫原的制备是将选择好的抗原溶解在适当的缓冲液中，使其保持稳定性，并且能够有效地诱导机体产生抗体。
制备好的免疫原需要进行一系列的检测，确保其纯度和活性符合要求。
接着，进行动物免疫。
通常情况下，选择小鼠、大鼠、兔子等动物进行免疫。
在免疫前，需要对动物进行适当的准备工作，如体重测量、免疫程序的安排等。
在免疫过程中，需要根据抗原的特性和动物的生理状态，合理地确定免疫剂量和免疫方案，以确保免疫效果的最大化。
随后，进行抗体的纯化。
在动物免疫一定周期后，可以从动物体内获取免疫血清，其中含有特异性抗体。
但免疫血清中还会含有大量的非特异性蛋白质和其他成分，需要进行纯化。
常用的纯化方法包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。
通过这些方法，可以将目标抗体从杂质中分离出来，得到纯净的抗体制剂。
最后，对制备好的抗体进行鉴定和检测。
鉴定抗体的纯度、活性、特异性等指标，确保其符合质量标准。
同时，也需要对抗体进行存储和保存，以确保其长期的稳定性和活性。
抗体制备原理是一个复杂而精细的过程，需要在每一个环节都严格控制，才能获得高质量的抗体制剂。
通过对抗体制备原理的深入了解，可以更好地指导抗体制备工作的实施，为科研和临床应用提供优质的抗体产品。
第03章抗体制备
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
抗体的制备
抗体的制备为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。
目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。
一、多克隆抗体大多数抗原是由大分子蛋白质组成，但只是抗原上有限部位的特殊分子结构能与其相应抗体结合，称此部位为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。
一种天然抗原性物质（如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等）往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。
在机体淋巴组织内可存在千百种抗体形成细胞（即B细胞），每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，当受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群，这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称之为细胞克隆（clone）。
同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，亦可称之为单克隆抗体。
在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是第一代抗体。
由于这种抗体是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。
二、单克隆抗体体内免疫法很难获得单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
如能将所需要的抗体形成细胞选出并能在体外进行培养即可获得已知特异的单克隆抗体。
1975年德国学者Kohler 和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（sheep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
抗体制备原理
抗体制备原理抗体是一种特殊的蛋白质，它在免疫系统中起着重要的作用，能够识别和结合特定的抗原分子。
抗体制备是指通过一系列的实验操作，从动物或体外细胞培养物中获得特定的抗体。
下面我们将介绍抗体制备的原理及其相关的实验步骤。
首先，抗体制备的原理是基于免疫反应的原理。
当外源抗原进入机体后，机体的免疫系统会产生对应的抗体，以保护机体免受外源抗原的侵害。
在实验室中，我们可以利用这一原理，通过注射抗原来激发动物的免疫反应，或者在体外培养细胞，使细胞产生特定的抗体。
其次，抗体制备的实验步骤包括抗原的选择、动物免疫、细胞培养、抗体纯化等环节。
首先，我们需要选择合适的抗原，通常选择纯化的蛋白质或多肽作为抗原。
然后，将抗原注射到动物体内，激发其免疫反应，产生特定的抗体。
对于体外细胞培养，我们需要将细胞培养在含有抗原的培养基中，使细胞产生抗体。
最后，通过亲和层析、离子交换层析等技术，我们可以将抗体从混合物中纯化出来。
在抗体制备的过程中，需要注意一些实验技术和条件。
例如，在动物免疫的过程中，需要控制好抗原的剂量和免疫的时间，避免过度刺激动物免疫系统。
在细胞培养过程中，需要保证培养基的质量和细胞的健康状态，以确保抗体的产生和稳定性。
在抗体纯化过程中，需要选择合适的纯化技术和条件，以保证抗体的纯度和活性。
总之，抗体制备是一项重要的实验技术，它在生物医学研究和生物制药领域有着广泛的应用。
通过对抗体制备原理的深入理解和实验操作，我们可以获得高质量的抗体，为科学研究和临床诊断提供有力的支持。
希望本文能够对抗体制备的原理有所帮助，谢谢阅读！。
抗体的制备与使用指南
抗体的制备与使用指南一、抗体的制备。
1. 免疫原的选择。
- 对于制备抗体，首先要确定合适的免疫原。
如果是针对蛋白质抗原，要保证其纯度尽可能高。
例如，从细胞裂解物中纯化目标蛋白，可以采用亲和层析等方法。
对于小分子半抗原（如药物分子等），通常需要将其与大分子载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联，以增强其免疫原性。
- 免疫原的剂量也很关键。
一般来说，初次免疫时，对于小鼠等小动物，蛋白质抗原的剂量可在10 - 100μg之间，具体剂量需要根据抗原的性质和动物的种类进行优化。
2. 动物的选择与免疫。
- 动物选择。
- 常用的动物有小鼠、大鼠、兔子等。
小鼠因为繁殖快、成本低，是实验室制备单克隆抗体时常用的动物。
兔子则常用于制备多克隆抗体，其血清中抗体产量相对较高。
- 免疫程序。
- 对于小鼠，初次免疫可采用皮下注射或腹腔注射的方式。
以皮下注射为例，可在小鼠背部多点注射免疫原。
初次免疫后，间隔2 - 4周进行加强免疫，加强免疫的剂量可以适当减少，一般为初次免疫剂量的1/2 - 1/3。
经过2 - 3次加强免疫后，可检测动物血清中的抗体效价。
3. 单克隆抗体的制备。
- 细胞融合。
- 在小鼠免疫后，取其脾脏细胞（其中含有产生抗体的B淋巴细胞），与骨髓瘤细胞（如SP2/0细胞系）在聚乙二醇（PEG）的作用下进行融合。
融合后的细胞具有两种细胞的特性，既能产生特异性抗体，又能在体外无限增殖。
- 筛选阳性克隆。
- 利用次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型的骨髓瘤细胞和HAT （次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶核苷）选择培养基进行筛选。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因为缺乏HGPRT酶而死亡，未融合的脾细胞在体外不能长期存活，只有融合成功的杂交瘤细胞能够生长。
然后通过ELISA等方法筛选出产生特异性抗体的阳性克隆。
- 克隆化培养。
- 对筛选出的阳性克隆进行克隆化培养，常用的方法有限稀释法和软琼脂平板法。
限稀释法是将细胞悬液进行连续稀释，使每个孔中理论上只含有一个细胞，然后培养这些细胞，形成单克隆的细胞集落，从而得到稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞系。
第三章 人工抗体的制备
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五、单克隆抗体的应用
（一）在血清学技术方面。
（二）在免疫学基础研究方面。
（三）在肿瘤治疗方面。如生物导弹。
（四）在抗原纯化方面。
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第三节 基因工程抗体
一、概念： 利用基因工程技术制备的抗体分子，称为基因工程抗体。这是分子水平的抗体。
优势：去除或减少 无关结构，保留或 增加天然抗体特异 性和生物学活性。
五、全套抗体基因库
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第四节 催化抗体
一、概念： 是具有催化活性的免疫球蛋白，也叫抗体酶。具有抗体的高度选择性和酶的高效催化性。
优点： 具有抗体的高
度选择性和酶的高
效催化性。
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二、催化抗体的制备：
如：细胞融合法、基因工程抗体技术、引入辅助因子法等。
三、催化抗体的应用：
如：在抗肿瘤方面的应用。在戒毒上也有重要应用价值。
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基本制备过程：
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一、嵌合抗体：
是指在同一抗体分 子中含有不同种属来 源抗体分子片段的抗 体。
嵌合抗体多为“鼠-
人”类型。
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二、重构抗体：
将鼠抗体超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区编码基因中，再将 此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，转染杂交瘤细胞，并表达嵌合的V 区抗体。
三、单链抗体：
单
需适当选择 产生高纯度抗体
无 悬浮培养：0.01~0.05
中空纤维： 小鼠
体外培养液：无7
三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体生产基本过程
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四、单克隆抗体的优势
高度均一性： 纯度很高的均一性抗体
高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应。
[课件]第3章抗体的人工制备PPT
![[课件]第3章抗体的人工制备PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/251c4063be1e650e52ea9944.png)
一、嵌合抗体
嵌合抗体 （chimeric antibody)是指同一 抗体分子中含有不同种属来源抗体片段 的看体，又称杂种抗体．主要有“鼠－ 人类型。”Fab或Ｆ（ab）2来源于鼠类， Fc来源于人类。这种杂交瘤细胞分泌的 抗体特异性和亲和力与原杂交瘤细胞相 同，但减少了鼠源性成分。
二、重构抗体
为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体中 的含量，将鼠抗体超变区基因嵌入人 抗体Fab骨架区的编码基因中，在将 此基因片段与人Ig恒定区基因相连， 然后转染杂交瘤细胞，使之表达V区 抗体，即为重构抗体（reshaping antibody）
三、单链抗体
单链抗体（single—chain antibody）又 称Fv分子。由VL区氨基酸序列VH区氨 基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。 肽连接物还可以将药物、毒素或同位素 与单链抗体相连。这种抗体分子小，免 疫原性低；在血清中清除快；无FC片段， 避免非特异性杀伤；能进入实体瘤周围 的微循环等。
四、Ig相关分子
将抗体的部分片段连接到一些有治 疗作用的毒素或药物上，取代Fc片 段，可直接发挥毒素或药物的治疗 作用，起“生物导弹”作用。 例如：CD4免疫黏附素治疗AIDS。
五、噬菌体抗体
噬菌体抗体（phage antibody）是 将一直特异性抗体分子的所有V区 基因在噬菌体中构成基因库，用噬 菌体感染细菌，模拟免疫选择过程， 具有相应特异性重链和轻链可变区 即可在噬菌体表面呈现出来。这种 技术成为噬菌体表面展示技术 （phage display technology）
脾
B 细 胞
骨髓瘤小鼠 取腹水
抗原
骨髓瘤细胞 + PEG, 融合 杂交瘤细胞
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4
抗体制备介绍
抗体制备抗体制备是生物技术领域中的一个重要过程，它涉及多个步骤，目的是为了获取特定的抗体，这些抗体可以用于诊断、治疗以及科学研究。
以下是抗体制备的一般流程：1. 抗原的选择与制备抗原选择：根据需要制备的抗体类型，选择相应的抗原。
抗原通常是一种能引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽、多糖等。
抗原制备：如果抗原是蛋白质，可能需要通过重组DNA技术在细胞中表达并纯化。
如果抗原较小，可能需要通过化学方法合成。
2. 动物免疫宿主选择：通常选用小鼠、大鼠、兔子或者羊等动物作为宿主。
免疫程序：将抗原与佐剂混合后，通过注射的方式引入动物体内，以刺激免疫系统产生抗体。
通常需要多次免疫才能获得足够数量的抗体。
3. 采集和检测采集血液：免疫数周后，从动物体内采集血液。
分离血清：血液离心后，取上层的血清，其中含有抗体。
检测抗体：通过ELISA、Western blotting、免疫荧光等方法检测抗体的特异性和亲和力。
4. 抗体纯化沉淀法：如铵硫酸盐沉淀法。
色谱法：包括离子交换色谱、亲和色谱（利用蛋白A或蛋白G 亲和抗体Fc区）等。
5. 抗体标记（如需）酶标记：如与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶结合。
荧光标记：如FITC或PE标记。
同位素标记：用于放射免疫检测。
6. 单克隆抗体制备（如果需要）融合：将已免疫动物的脾细胞与恒温动物骨髓瘤细胞融合。
筛选：利用HAT培养基筛选出能够产生所需抗体的杂交瘤细胞。
克隆：将杂交瘤细胞进行单细胞克隆，确保抗体的一致性。
培养和扩大：将筛选出的杂交瘤细胞在体外培养或者在特定的动物体内扩大。
抗体采集和纯化：从培养基或动物的腹水中采集含有单克隆抗体的液体，并进行纯化。
7. 质量控制抗体活性：检测抗体的亲和力和特异性。
抗体纯度：通过SDSPAGE、HPLC等方法检测纯度。
抗体稳定性：进行长时间存储后，检测抗体的稳定性。
8.包装和保存包装：按照需求包装成不同规格。
保存：通常在低温条件下保存，例如20℃或者80℃，有时添加甘油或蛋白稳定剂。
抗体制备原理
抗体制备原理
抗体制备原理：
抗体是免疫系统中一种特殊的蛋白质，能识别和结合到体内外的抗原分子，并参与免疫反应。
抗体制备是通过免疫原与免疫动物（如小鼠、兔子等）的免疫系统进行相互作用，使免疫动物产生特异性抗体的过程。
抗体制备一般包括以下几个关键步骤：
1. 免疫原选择：选择与目标抗原相关的合适免疫原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白等。
免疫原通常需要具备良好的纯度和完整性。
2. 免疫动物免疫：将选择的免疫原注射到免疫动物体内，通常会进行多次免疫，以激活免疫系统，使其产生针对免疫原的特异性抗体。
3. 抗体检测：在免疫动物免疫一段时间后，通过抗体检测方法（如ELISA、Western blot等）检查免疫动物体内是否已产生特异性抗体。
可选用已知抗原的标准抗体对比，以确定产生的抗体特异性。
4. 免疫细胞融合：将免疫动物的脾细胞或淋巴细胞提取出来，并与骨髓瘤细胞进行融合。
骨髓瘤细胞是一种恶性细胞，具有无限增殖潜力，融合后能够长期保存抗体合成所需的基因。
5. 杂交瘤筛选：将融合细胞进行限稀稀释，使其单个细胞分散
于培养基中，便于各个细胞独立地生长。
然后通过对培养基中的细胞进行筛选，选择出能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体培养：将筛选出的杂交瘤细胞进行分离和培养，使其形成单克隆细胞株。
每个单克隆细胞株都来自于同一个B 细胞，因此能够产生具有相同抗原特异性的抗体。
7. 抗体纯化：将培养出的单克隆抗体进行纯化，去除杂质和不需要的成分，得到高纯度的抗体样品。
以上是一般的抗体制备原理，不同实验室和具体实验会根据需要和条件进行微调或改进。
3.抗体的人工制备
第三章抗体的人工制备由一个祖先细胞增殖而形成的一群细胞称为克隆(clone，无性繁殖系)一个B细胞克隆只能产生针对一种抗原表位的抗体;一个浆细胞只能分泌一种类型的抗体第1节多克隆抗体一、多克隆抗体的概念①将抗原物质经不同途径注入动物体内，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得的抗血清即为多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)，简称多抗。
②从天然感染康复动物采取的血清。
无论是细菌抗原，还是病毒抗原，都含有多种抗原成分。
即使是纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位，进入机体后可激活多种淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原或抗原决定簇(表位)的抗体, 由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性。
进一步讲，针对同一抗原决定簇的抗体仍是由不同B细胞克隆产生的不同质的抗体。
二、多克隆抗体制备的基本过程1.抗原制备2.动物免疫3.试血测定抗体效价4.血清分离与保存5.多抗纯化与标记三、多克隆抗体的用途1.用于血清学实验——作为阳性血清或标记抗体(血清凝集实验/沉淀实验/补体结合实验/中和实验/免疫标记技术/免疫转印技术) 2.治疗制剂——可用于一些传染病的紧张预防和治疗第 1 页/共 6 页第2节单克隆抗体一、单克隆抗体的概念单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。
将产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化的B细胞杂交瘤产生的抗体即为单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)，简称单抗。
二、单抗与多抗的比较与多克隆抗体比较，单克隆抗体具有无可比拟的优越性：高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低并可大量生产等。
三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体的制备1.B细胞的制备小鼠脾细胞悬液2.骨髓瘤细胞的制备免疫相同来源的小鼠骨髓瘤细胞3.饲养细胞的决定融合之前, 将饲养细胞制成所需的浓度参加培养板孔中。
免疫学检验-3-抗原抗体的制备
1.酶处理法
• 利用组织和微生物自身的酶使其细胞裂解
• 特点：①动物组织细胞的自溶温度常选0～4℃，
②微生物自溶温度常选室温。
1.酶处理法
• 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等
• 方法：在一定的条件下，能消化细菌和组织细胞。 • 特点：①此法适用多种微生物；
②具有作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
•超速离心是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手段，可作为 进一步纯化的第一次过筛。超速离心又分差速离心和梯度离心。
二、可溶性抗原制备及鉴定
•选择性沉淀法
•核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素 •盐析沉淀法－硫酸铵、硫酸钠 •有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 •非离子型聚合物沉淀法－聚乙二醇
•凝胶过滤和离子交换层析 •亲和层析
•免疫动物选择 •免疫剂量的选择 •免疫时间和途径的选择 •免疫佐剂的应用与选择 •免疫失败的可能原因及应采取的措施
• 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。
1.抗原与免疫动物的种属关系:亲缘关系越远越好；
2.动物的机体状态：选适龄、健壮、无感染的正常动物、 雄性,体重合乎要求；
• 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外
溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
• 方法：将待破碎的细胞置-20℃冰箱内冻结，然后
室温缓慢融化冻结，如此反复两次，大部分组织细 胞及细胞内的颗粒可被融破。
• 特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较
差。
3.超声破碎法
•原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。
各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度。
实验三 抗体的制备(胡荣)
5、抗血清保存
4℃保存（3~6M）； 低温保存（3~5Y）； 真空干燥保存（5~10Y）。
（四）、注意事项 1、正确抓握家兔、注意抚摸； 2、做好自我保护，防止抓伤或咬伤； 3、保持安静，不要大声喧哗； 4、有团队合作精神！ 5、整理干净桌面（84消毒液消毒）！！
单克隆抗体的制备（看视频）
过程：1、细胞的选择与制备 2、细胞融合 3、杂交瘤细胞选择培养 4、杂交瘤细胞克隆化培养与冻存 5、单克隆抗体的大量制备 6、单克隆抗体的纯化和鉴定
Ab产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的 途径免疫动物，经初、再次免疫后，使动物血 清中产生足量的特异性Ab，继而分离、纯化血 清，得到相应的Ab。（PcAb）
（二）、试剂与器材 1、 抗原与免疫对象
Ag1：伤寒沙门菌“O”抗原； Ag2：混合人全血清； 免疫对象：健康家兔（24只:12只/班）。
（4）加强免疫 免疫途径、剂量、间隔时间见免疫方案。
（5） 试血 末次免疫7天后即试血，耳静脉采血，分离血
清，与伤寒沙门菌"O"抗原作试管凝集试验，凝集 效价在1：600~3200之间时即可放血，若效价较 低可继续加强免疫。
（6）放血 心脏采血（末次免疫后5-7d）。
2、抗人血清的制备
（1）弗氏佐剂的制备 弗氏不完全佐剂： 称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml（羊毛脂：石 蜡油约为1：1~1：4），高压灭菌后4oC保存备用。 弗氏完全佐剂： 于不完全佐剂中加入2~20mg/ml卡介苗，研钵中乳 化后即成为完全佐剂，冰箱保存备用。
。试血时，双扩试验效价达1：16以上即可收 集血清。如效价不高，可追加免疫。
（6） 抗血清采集 心脏采血。
３、 抗血清的鉴定
内容：效价、特异性、纯度、亲和力 方法：颗粒性抗原效价→凝集试验
第三章 人工抗体的制备
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四、其他基因工程抗体：
如:Ig相关分子：将抗体分子部分片段连接到与 抗体无关的序列上得到。
噬菌体抗体：将已知特异性的抗体分子的
所细有菌五，V区模、基拟全因免套在疫噬抗选菌体择体过基中程因构，库建使基具因有库相，应用特噬异菌性体的感重染
如：在抗肿瘤方面的应用。在戒毒上 也有重要应用价值。
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三、多克隆抗体制备过程
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第二节 单克隆抗体
一、概念： 是指由一个B细胞分化增殖的子代
细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇 的抗体，简称单抗。
特点：高特异性、高均一性
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抗体产生细胞
多克隆性
单克隆性 二、单抗与多抗的比较
同质性
高度异质
高度同质
特异性 高，与特定
较高，与抗原上
决定簇 结合
小鼠腹水： 0.5~1.0
10~15
其他血清蛋白
有
体外培养：少量
牛血清白蛋白
小鼠腹水：少量杂蛋白
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三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体生产 基本过程
度均一性： 纯度很高的均一性抗体
高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应。
大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代。
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五、单克隆抗体的应用
（一）在血清学技术方面。 （二）在免疫学基础研究方面。 （三）在肿瘤治疗方面。如生物导弹。 （四）在抗原纯化方面。 （五）用于制备实用抗文档独特型抗体疫苗。
第三节 基因工程抗体
一、概念： 利用基因工程技术制备的抗体分子，
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二、杂交瘤细胞的制备过程
亲本细胞的选择和融合 选择培养基的应用 抗原特异性杂交瘤细胞的筛选
三、单克隆抗体的生产
大量制备单克隆抗体的方法主要有两种，一种是动 物体内诱生法，另一种是体外细胞培养法。
动物体内诱生法 是目前McAb大量制备的主要方法。 体外细胞培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行 培养。 兔单克隆抗体
第一节 免疫原的制备
免疫原（immunogen）是能刺激机体免疫系统产生特 异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
在抗体制备过程中，多种因素能够影响所制备抗体的 质量，但高质量的免疫原是制备合格抗体的前提条件。
一、颗粒性抗原
颗粒性抗原主要包括人和各种动物细胞抗原、细菌抗 原和寄生虫抗原等。常用的抗原为: 绵羊红细胞、细菌抗 原和细胞膜抗原。
一般采用的纯化方法有超速离心法、选择性沉淀法、 凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。
（三）免疫球蛋白片段的制备
免疫球蛋白片段的制备方法有解离二硫键、溴化氰裂 解法和酶裂解法。
三、半抗原
半抗原（hapten）是指只有抗原性而无免疫原性的物 质，如多肽、多糖、甾族激素、核苷、某些药物以及其他 化学物质等。
含Fab段或Fv的抗体融合蛋白 将Fv与某些毒素、细胞 因子及酶等的基因拼接，通过Fv的引导可将其生物活性物 质导向靶细胞特定部位，更有效地在局部发挥生物学功能 而降低毒副作用。
含Fc的抗体融合蛋白 将某些功能性蛋白分子与抗体 Fc段融合可产生两种效果:①延长该蛋白在体内的半衰期； ②通过功能性蛋白与其配体的作用，将抗体Fc段的生物学 效应引导至特定的目标。
一、人源化抗体
人源化抗体(humanized antibody) 是指利用基因 克隆及DNA重组技术对产生鼠源McAb的杂交瘤细胞内抗 体基因进行改造，使其分泌的McAb中大部分氨基酸序列 为人源序列所取代，既保留了亲本鼠McAb的特异性和亲 和力，又降低mouse chimeric antibody ） 是利用DNA重组技术，从杂交瘤细胞中分离出鼠源 McAb功能性IgV区基因，与人IgG C区基因连接成嵌合基 因后， 插入适当的表达载体中，构建人-鼠嵌合的重链 和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞中表达的抗体 。
1.抗原结合片段(Fab) 由一条完整的L链和约1/2的H链 组成，具有与完整抗体相同的抗原结合特性，但只能结合 一个抗原表位。
2.可变区片段(Fv)和单链抗体(ScFv) Fv是抗体分子 中保留抗原结合部位的最小功能性片段，是由VL链和VH链 以非共价键结合而成的单价小分子，为完整抗体的1/6。
方法简单易行 筛选容量增大 直接得到抗体的基因 可模仿体内免疫过程 可以获得一些用传统方法难于制备的抗体
一、佐剂的种类
主要包括：生物性佐剂、无机化合物佐剂、人工合成 佐剂。
弗氏佐剂（Freund adjuvant,FA）可分为:弗氏不完 全佐剂、弗氏完全佐剂。
佐剂与抗原混合乳化的方法有两种：研磨法、搅拌混 合法。
二、佐剂的生物学作用
1.增强抗原免疫原性，使无或弱免疫原性的物质成为持 久或强免疫原。
2.双特异抗体分子片段的细胞内组建 通过对小分 子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双特异抗体分 子，较体外组建更为简便有效。
（二）双特异性抗体的应用
在免疫检测中的应用 在肿瘤放射免疫显像中的应用 双特异性抗体介导的药物杀伤效应 双特异性抗体介导的细胞杀伤效应
四、抗体融合蛋白
抗体融合蛋白(antiteody fusion protein)是指 利用基因工程方法重组表达的抗体片段与其他生物活 性蛋白融合的产物。
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ -球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
五、噬菌体抗体库技术
抗体库技术（antibody library）是将某种动物的所 有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同 的抗原筛选出携带特异性抗体基因的克隆，从而获得特异 性的抗体。
抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破①PCR技 术的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫 球蛋白可变区基因；②利用大肠杆菌成功表达出具有抗原 结合功能的抗体分子片段。
3.刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答。
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌 特异性抗体能力的致敏B细胞与具有无限繁殖能力的骨髓 瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有两种亲代细胞的特性，既保留了 骨髓瘤细胞在体外培养无限增殖的特点，又继承了致敏B 细胞可合成和分泌特异性抗体的能力。
杂交瘤技术使用的选择培养基是在普通细胞培养液中 加入次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨基喋呤（aminopterin,A ）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字头称 为HAT培养基。
二、可溶性抗原
蛋白质（糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体和细菌外毒素 ）、多糖和核酸等都是可溶性抗原。
（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
组织细胞抗原的制备：粉碎的方法有两种：高速组织 捣碎机法和研磨法。
细胞可溶性抗原的制备：常用的细胞破碎方法有超声 破碎法、酶处理法、冻融法和表面活性剂处理法。
（二）可溶性抗原的纯化
抗原的注射剂量应考虑抗原的免疫原性的强弱、分子 量大小、动物的个体状态和免疫时间。
三、免疫程序
动物产生抗体的过程符合抗体产生的一般规律—即初 次免疫应答和再次免疫应答的规律。一般在首次接触抗原 7天～10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14天～21 天内达到高峰，随后开始下降。
通常首次免疫后3周左右进行加强免疫，加强免疫至 少2次，必要时需3次～5次。
兔单克隆抗体
兔McAb在ELISA试验和免疫组化（IHC）中拥有更高的 亲和力和特异性。
兔McAb能够以识别许多在小鼠中不产生免疫应答的抗 原。
由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高 通量筛选融合细胞成为可能。
与鼠McAb的人源化相比，兔McAb的人源化更容易。
四、单克隆抗体纯化
预处理常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法。 纯化方法：一般采用盐析、凝胶过滤、辛酸提取和离子 交换层析等方法进行纯化。 最有效的McAb纯化法为亲和层析法。 常用SPA或抗小鼠Ig抗体与琼脂糖交联，制备亲和层析 柱将抗体结合后洗脱，可获得高纯度的单抗。
3.重链抗体（heavy chain antibody, HcAb） 是 指缺失L链的H链同型二聚体。
通过基因工程可以获得保留抗原结合活性的重链抗 体可变区，也称为单域重链抗体（single domain heavy chain antibody,sdHcAb）。
重链抗体以其分子量小，稳定性高，免疫原性弱， 组织穿透力强，可以结合一些常规抗体无法接近的抗原 表位等特点，显示出其与常规抗体相比在抗体-抗原结 合及免疫防御中的优势。
第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第三章 抗体制备
王辉
目录
第一节 免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 第三节 多克隆抗体的制备及应用 第四节 单克隆抗体的制备及应用 第五节 基因工程抗体及应用
抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性免疫应答的 重要产物，也是免疫学实验中的常用试剂，对于抗原的分 析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学实验室诊断中 广泛应用。
为进一步降低抗体的免疫原性，人们应用基因工程技 术将鼠源McAb中互补决定区(complementarity determining region，CDR)移植至人源抗体可变区，替代 人源抗体CDR，即为CDR植入抗体。
二、小分子抗体
小分子抗体是指分子量较小但具有抗原结合功能的分 子片段。
优点表现为:分子量小、 可在大肠杆菌等原核细胞中 表达、免疫原性要比原来的McAb弱得多、不含Fc段有利于 作为靶向药物的载体、半衰期短、周转快有利于放射免疫 成像检查肿瘤。
噬菌体抗体库（phage antibody library）技术就 是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变 区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上 并以融合蛋白的形式表达在噬菌体外壳表面。
噬菌体抗体库分为3种： 天然抗体库(naive library) 免疫抗体库(immune library) 合成抗体库(synthetic library)
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体（McAb）的特点是理化性状高度均一、纯 度高、特异性强、少或无血清交叉反应的特点，易于实验 标准化和大量制备。
三、双特异性抗体
双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)是指同 时能与两种不同特异性的抗原发生结合的抗体。它不同于 天然抗体，其两抗原结合部位具有不同的特异性。
（一）双特异抗体分子的构建
1.双特异抗体分子片段的体外构建 利用一个二 聚化结构域将两个ScFv组装成一个异二聚体分子，例如 亮氨酸拉链(leucine zipper) 为二聚化结构域可连接 两个小分子抗体。