oligo7官方说明 中文版

稳定性较差的引物与产物相差30°Tm。一组警告并不会取消它的资格，而只是表明它可能不是最优的选择。 当警告是“前向起爆药的终端稳定性太高”时，并不意味着反应会受到任何损害。这意味着当使用复杂的 底物时，如基因组DNA或逆转录的总mRNA，你可能会有错误的产物形成问题。至少有必要仔细检查预测产品 的大小。
The next slide shows the calculation graphically (data for temperature of 37° ).
DG 计算示例
Total DG = 1+1+0.3+0.5-1.3-1.3-2.2 = -2.0 kcal/mol
这是一种罕见情况。通常情况下，悬挂的末端正在稳定下来。这是在提醒你，有时添加一个基 地可能会降低双相熔化温度，后面展示了一个即使添加两个碱基也不会影响TM的例子
在搜索引物和探针之后，您可 以打开选定的寡核苷酸窗口。 在此示例中，在所选寡核苷酸 窗口底部列出的文件中执行了 对一致性引物的排序搜索(要以 此方式搜索，您需要单击 Search for Primer&Probe(搜 索引物和探针)窗口的 “SubSearches”(子搜索)选项 卡，然后单击“Consensus Primers”(一致性引物)检查 框中，选择文件并开始搜索。)。选中“选择共识寡核 苷酸”框时，如右图所示，当您双击显示有关给定引 物信息的行时，Oligo 7会选择共识引物。
引物位置的列表可以通过点击(或按住Option键单击)窗口的标题来按分数、寡头位置或/和窗 口的任何其他列进行排序。左上角的下拉菜单允许您选择正向或反向引物显示。在搜索T aqMan集合或嵌套引物之后，您将有更多的选择。
寡核苷酸设置窗口
搜索PCR引物(上图)、TaqMan探针 (2ndimage)或嵌套引物(两幅下图)后，将 打开寡核苷酸集窗口。通过单击此窗口中 的任何行，您就选择了一个集合。双击会 导致打开PCR分析窗口。窗口显示引物和探 针的位数、收到的分数、PCR产物的长度和 最适退火温度以及GC含量。单击列标题时 ，可以对集合进行重新排序。 如果是嵌套引物结果，您可以通过单击 “U/L产品”按钮将外部引物PCR数据的显 示更改为内部显示，如下图所示。 下一张幻灯片上显示的PCR窗口中提供了有 关任何给定集合的更多信息。
PCR窗口
在手动选择引物或搜索PCR引物、TaqMan探 针或嵌套引物之后，您可以打开PCR窗口。 选择套式引物后，您可以检查外部引物PCR 产物(“F/R产品”)或套式引物产品数据 (“U/L产品”)。该窗口以图形方式显示 PCR产物和引物的整个序列和位置。此窗口 列出最佳和最高退火温度，以及产品和底 漆的Tmand GC%含量。还给出了分数(质量 度量)。在下表中，您可以看到可以随时编 辑的盐和底漆浓度。当底漆形成二聚体、 Tmor太低或与底漆相比产品TMIS过高时， 注释框会显示警告。在后一种情况下，预 计PCR产量会比正常情况低，但这本身通常 不会完全抑制反应；此警告的阈值是
• 3. 搜索选项 - 搜索引物和探针 - 其它搜索 - 批处理
• 4. 寡核苷酸数据库 - 复合
• 5. 结束语
引物稳定性计算
最邻近法介绍
引物最重要的特性之一是其熔点和各区域的稳定性.最邻近法提供最精确的 Tm 计算. 引物 Tm 值计算比较复杂:
Tm (°C) = DH/(DS + R * ln[C]) + 16.6 log [K+]/(1+0.7*[K+]) – 273.15 其中 DH and DS是螺旋形成的焓和熵。R是摩尔气体常数(1.987 cal/°C * mol),c是引物 探针的浓度（通常用于比目标DNA多出几倍的情况),可用电脑进行计算. 为了理解双相稳定 性计算的复杂性，通过展示自由能 (DG, 另一种衡量DNA稳定性的方法), 公式更简单:
熔化温度图形窗口，续
当点击“DG”行时，将显示没有悬垂末端的自由能图。如果您有退化序列文件，也可以选择GC%内容显示或退 化图。请注意，TM、DG GC%或简并度数据是针对当前寡核苷酸大小的DNA片段给出的(以红色字母显示，并可使 用更改当前寡核苷酸长度命令进行更改)。在窗口的顶部也有放大和缩小图标，类似于放大镜。您可以选择不 同的放大样式。例如，缩小操作将创建此类型的窗口：
窗口的底部显示了序列的放大部分，在Tm图形中以黄色高亮显示(此图的左上角)。光标位置和 将从光标位置开始的oligo的Tm显示在右侧，刚好位于位置数字刻度的上方。在标度以下你可 以看到DNA序列，其中正链是红色的。如果你选择引物，它们会出现在序列的上面和下面。翻 译后的蛋白序列以各种颜色显示。颜色象征密码子的频率(黑色是最频繁的，看到打开的阅读 框窗口)。下面的行和它们的颜色象征着相同的特征，但是放大了，显示在Tm graph下面。更 详细的解释在下一张幻灯片。
影响PCR反应的其它非引物因素
除了上一页列出的引物属性外，PCR效率还取决于模板。具有高二级结构 和GC岛的区域扩增较差。寡核苷酸7惩罚了那些会扩增强大发夹结构的引 物，从而降低了PCR引物集的总得分。
如果您必须使扩增产物变得困难，请选择得分较高的引物(通常Tm and GC含量高于标准)，并通过添加溶剂、添加剂或减少/改变盐来调整PCR组 合的组成。由于非特异性引物/引物延伸，不建议将引物浓度提高到1 mmol以上(即使软件没有显示任何3‘-二聚体)。
二聚体信息窗口
双链形成窗口显示最 强的3‘-双链，不一 定在3’端的最稳定的 双链，以及最强的发 夹。DG数据是在考虑 悬挂端和起始DG值的 情况下给出。MIXED OLOOS DUPLEX窗口不 显示发夹
发卡结构窗口
发夹形成窗口显示给定寡 核苷酸中所有可能的发夹 ，从最强到最弱列出。当 给定的管段涉及许多不同 的结构时，由于结构之间 的竞争，特定发夹的实际 熔化温度比计算的要低
如何设计好引物
1. 一个好引物应具有以下几点
- 具有相当高的 Tm, - 没有二聚体，特别是在它们的3’端没有发卡结构（防治自引发） - 缺乏重复序列以确保快速和正确的退火。 -同一孵化混合物中的所有引物/探针之间不应形成显著的3‘二聚体。
2. 高特异性引物设计要点
- 足够长，以增加特异性 -唯一，特别是在其3‘-端，以避免假引发 -在其3’-端适度稳定(而不是高度富含GC)，以确保非常短的片段不会初始化延 伸(太低的3‘-端稳定性会损害引发效率)。
同源性窗口
同源窗口显示探针的同源位点， 并从相似性最高到最低列出位点 。在这种情况下，3‘端是不相关 的，探针(或引物)的同源性与实 际的DNA链对齐，而不是与其补体 对齐，就像在假启动位点窗口中 一样。当在杂交实验中使用较短 的DNA片段时，同源性低于90%通 常不显著，也不会产生错误信号 。
选定的寡核苷酸窗口
这是一个屏幕截图显示选择的引物和探针
上游引物Tm 是56.7°, 下游引物 Tm 是 56.2° (差别不大). 两端各加一个碱基，选择片段为上下两个 核苷酸，上核苷酸Tm 为 56.7° (no change in Tm) 下核苷酸 Tm 上升至 61° (from 56.2°).在不考 虑垂悬末端的情况下，增加引物长度会增加 Tm.您将在关键信息窗口说明中看到这些特定寡头的更全面 的分析数据。
彩色矩形中的图形在缩放区域中展开
使用Oligo可以选择最多4个引物或探针
序列窗口中其他符号的说明
模板中更强的发卡结构
潜在引物中弱茎形成中涉及的核苷酸
回文
搜索字符串找到的结果
高亮功能
关键信息窗口
关于这些寡糖的更多统计数据提供了它们的组成和tm窗口，以及浓度窗 口。
关键信息窗口显示所选 引物或探针的基本信息 .这些是在前一节中讨 论的寡聚体,其中较长 的13mer寡聚体(左下) 具有与上面显示的较短 的11 mer寡聚体相同的 Tm。tm是在不考虑悬垂 端影响的情况下计算出 的熔点温度，该温度增 加了近7°。值得注意 的是，同长度的互补寡 核苷酸如右图所示，其 tm与预期相同，但tm不 同，尤其是13-mers。
DG = DH – TDS (是温度，单位是K). 虽然看起来简单，但还是比较复杂这是一个计算4-mer TCGA长链的例 子:
DG 可用如下公式计算:
DG (TC) + DG (CG) + DG (GA) + initiation DG for T + initiation DG for A + DG of 3’-dangling end AC + DG of 5’-dangling end GT
Oligo 7 Primer Analysis Software
PCR引物选择和软件演示规则
Ⓒ 2010 Molecular Biology Insights, Inc.
目录
• 1. PCR 引物选择标准 - 引物稳定性计算 - 如何设计好的引物 - 影响引物特性的其他因素
• 2. Oligo 7 分析特征 - 序列窗口 - 一般信息 (关键信息) - 二聚体和发卡 - 引物相关数据(组成和融化温度) - 假引物位点和同源性分析 -寡核苷酸稳定性图 (Tm, DG) - 内部稳定性及意义 - 序列频率 - 其它DNA分析选项
组成及Tm 窗口
成分和Tm窗口显示用不同的方法计算的熔化温度，即
最近邻法(TDI是归一化的Tmi1M盐条件，而TM是一个变
量值，取决于在搜索参数窗口中设置的盐和DNA浓度)
。
使用%GC方法计算的
TmCalculated不依赖
于搜索参数设置。文
中还给出了最简单的
Tm值计算方法(A或T为
2°，C或G为4°)，然
The LCR Window
这个窗口帮助设计连接酶链式反应的探针。当您单击左上角的任何突变按钮时， 会设计一个特殊的寡核苷酸来通过LCR检测此突变。当这种酶用尾巴连接一个较长 的寡核苷酸时，你就可以通过凝胶电泳检测到它。
熔化温度图形窗口
Tm窗口显示序列窗口的放大Tm graph。它还控制序列窗口图形的显示。在本例中，您可以看到tm graph实际上 就是tm graph，如窗口右上角所示。这意味着，这是“标准的”熔融温度，不考虑悬垂端，因此两个支架的寡 聚具有相同的TM。在“现实生活”中，情况并非如此，因为给定的寡核苷酸及其补体的TM是不同的，因为有不 同的悬垂末端(当目标是一条长链时)。此窗口有多个选项，允许显示带有悬挂端的TM图以及带有或不带有悬挂 端的DG值。要更改显示，请单击窗口
Oligo 7 分析特征：序列窗口
在表的下面，您可以看到寡核苷酸稳定性图(默认为Tm)。这是一个小型化的熔化温度图窗口，可以从分析菜 单中找到。在Tm图形下面有一系列的水平线。每一行可以包含在整个序列中展开的各种特征的图形表示，如 引物位置、PCR产物等。在这个例子中，第一个填充的行是一个红色矩形图案，它代表了弱的发夹环，还没有 被选择的引物。红色行下面的绿色矩形表示回文。最后一行用蓝色线表示编码序列，特征表高亮显示“CDS”。
Oligo 7 分析功能：序列窗口
序列窗口是中央窗口，显示序列和所选引物的几个特征。当您打开随软件提供的测试序列时，您将看到 此屏幕：:
序列文件名在左上角。在顶部你还可以看到3个表格。左边的第一个显示的是序列长度、翻译 的阅读框(蛋白序列是一串彩色的字母，位于底部)、当前Oligo(序列被一个灰色矩形包围)的 长度和位置，以及它的Tm。第二张表列出了所选引物的位置，oligos(点击oligo名称左侧的方 框进行选择)和PCR产物(需要选择2个引物)。单击“i”，以获得更多有关选定的Oligo的信息。 第三个表列出了序列特性(如果存在序列注释/特性;您可以从编辑菜单手动输入它们)。
后计算了RNA和
DNA/RNA杂交物的Tm值。
第二个表列出了碱的
组成，最后一个表列
出了用最近邻法计算
的各种盐和甲酰胺浓
度下的TM值。
虚假启动点窗口
假引发点窗口显示引物的潜在假 引发点。这个特殊的例子显示了 一种旧的商用通用M13反向引物。 PE为244点的位点是实验确认的唯 一真正的假启动位点(Steffens， D.L.，Sutter，S.L.和Roemer， S.C.(1993)“An Alternate Universal Forward Primer for Improven Automated DNA Sequence of M13”， BioTechniques 15，580-582)。