第七章-发酵染菌与防治教案资料
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目前常用的方法：
（一）显微镜检查 （二）肉汤培养检查法 （三）平板划线培养或斜面培养检查法 （四）发酵过程的异常现象观察法
（一）显微镜检查
1、细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色 和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ毛染色，霉菌、酵母菌可直接观察。
（二）肉汤培养检查法
1、方法
液体培养基的检查:将需要检查的样品接入经灭菌， 并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃ 分别培养24h，进行观察，观察肉汤是否浑浊。并 取样镜检。
（二）平板划线培养或斜面培养检查法
１、平板划线培养 固体平板置培养箱中37℃，保温24h，检查无菌
即可使用。将需要检查的样品在无菌的平板上划 线，分别置37℃、27℃培养，以适应嗜中温和 低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
培养后，若出现与生产菌株形态不一的菌落，表 明可能被杂菌污染。
２、噬菌体检查——双层平板培养法：
第一节 发酵异常现象及染菌分析
一、发酵的异常现象 二、染菌检查 三、染菌的原因及分析 四、染菌隐患的处理
一、发酵的异常现象
（一）种子培养的异常现象 （二）发酵的异常现象
（一）种子培养的异常现象
1、菌体生长缓慢 原因：种子质量差、培养基成分不稳定、
培养条件没有控制到位。 2、菌丝结团 原因：种子、培养条件、培养基。 3、代谢不正常 原因：培养基不合适、培养环境不良、接
（2）措施：检查无菌空气、管道是否渗 漏。搅拌设备是否正常运行等。
4、泡沫过多
发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。 （1）原因：种子过嫩或过老，致使菌体生
长差、代谢速度慢，蛋白质胶体物质多。 培养基灭菌温度过高或时间过长，培养基
成分受到破坏。 （2）措施：接种优质种子、对培养基进行
合理灭菌。
（1）原因：培养基原料差、灭菌不彻底、加糖过 于集中等。
（2）措施：可通过加酸或碱调节。最好加入一些 生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。
3、溶氧水平异常（p164）
正常发酵过程的溶氧水平是由一定规律的 。如果溶氧水平与一般规律不一致即发生 了异常变化。
（1）原因：染菌。染菌的种类：好氧菌 、厌氧菌。菌体代谢异常、某些设备或工 艺发生故障或变化。
（二）染菌原因及分析
归纳发酵中染菌的主要原因有以下几方面： 无菌空气带菌、设备渗漏、种子带菌、灭菌
不彻底、操作失误和技术管理不善等。 但还要具体问题具体分析。可从污染的杂菌
种类、污染的时间、污染的程度等方面进行 综合分析，才能作出正确的判断，从而采取 相应的对策和措施。（p186-188）
1、染菌的杂菌种类分析
底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量 ，先将灭菌的底层培养基溶后倒平板，凝固后 ，将上层培养基溶解并保持40℃，加生长菌作 为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板 上，置培养箱保温经12～20h观察有无噬菌斑。
（四）发酵过程的异常现象观察法 （p186）
如可从溶解氧、pH值、排气中CO2含量、 菌体酶活力等变化来判断。
。 微生物的浓度过高，发酵液过浓： （1）原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发
酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。 （2）措施：补入大量的水。
二、染菌检查（p185-186）
在发酵过种中，对杂菌污染的及早发现、 及时处理，是免除染菌造成严重损失的重 要手段。因此，要求有确切、迅速的方法 来检测出污染的杂菌。
第七章-发酵染菌与防治
几个问题：
1、染菌 2、染菌途径 3、染菌检查的方法 4、染菌防治的方法
发酵染菌防治的意义：
现代发酵利用的是微生物的纯培养技术。 要严格无菌操作技术。
防止发酵过程中的染菌有着重要的意义： 保证产品的质量、收率的稳定。 保证发酵生产的有序进行。 有利于节约型社会的建立。
。 （2）部分发酵罐 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵后期：中间补料染菌、补料管渗漏。 （3）个别发酵罐染菌 一般原因是设备渗漏造成的。
3、不同污染阶段分析
1、溶解氧水平异常变化显示染菌。 2、pH异常变化显示染菌。 3、排气中CO2异常变化显示染菌。
谷氨酸正常发酵和异常发酵溶氧水平曲线：
三、发酵染菌的原因
（一）发酵染菌率
是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比 。
发酵染菌批数
总染菌率=——————100％
总投料批数
发酵染菌率是指在发酵罐中发生的染菌率，包括染 菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的 染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。
杂菌不同染菌的原因不同：（p187）
杂菌
原因
耐热的芽孢杆菌 养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角
球菌、无芽孢杆菌等真菌 设备渗漏、无菌操作不当、培养
基灭菌不彻底等
2、发酵染菌规模的分析
（1）大批发酵罐染菌 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵中后期：如是同一种菌则是无菌空气出问题
种量少、污染杂菌。
（二）发酵的异常现象（p184-185）
1、消耗缓慢（菌体生长差）
（1）原因：产生菌孢子和种子质量不好、发酵条 件差、培养基质量差（灭菌不当）等。
（2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发 酵温度。
2、pH异常
发酵过程中一般pH是有一定规律的。如不符合规 律则是发酵异常。
5、菌体浓度过高或过低
由于温度、氧气、培养基、种子质量、菌体自溶等影响微生 物的生长，或感染噬菌体等，导致发酵液中微生物的浓度过 高或过低。
微生物的浓度过低，发酵液转稀： 指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。 （1）原因：感染噬菌体、培养条件不合适。 （2）措施：防噬菌体、控制合适培养条件。 未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可
无菌空气的检查:将葡萄糖酚红肉汤培养基装在吸气 瓶中，灭菌后，37℃培养24h，若培养液未变浑浊 ，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，把过滤后的空 气引入吸气瓶中，培养后，若培养液变混或变黄色 ，表明空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题。
2、应用
（1）空气过滤系统。 （2）液体培养基。 （3）噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
（一）显微镜检查 （二）肉汤培养检查法 （三）平板划线培养或斜面培养检查法 （四）发酵过程的异常现象观察法
（一）显微镜检查
1、细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色 和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ毛染色，霉菌、酵母菌可直接观察。
（二）肉汤培养检查法
1、方法
液体培养基的检查:将需要检查的样品接入经灭菌， 并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃ 分别培养24h，进行观察，观察肉汤是否浑浊。并 取样镜检。
（二）平板划线培养或斜面培养检查法
１、平板划线培养 固体平板置培养箱中37℃，保温24h，检查无菌
即可使用。将需要检查的样品在无菌的平板上划 线，分别置37℃、27℃培养，以适应嗜中温和 低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
培养后，若出现与生产菌株形态不一的菌落，表 明可能被杂菌污染。
２、噬菌体检查——双层平板培养法：
第一节 发酵异常现象及染菌分析
一、发酵的异常现象 二、染菌检查 三、染菌的原因及分析 四、染菌隐患的处理
一、发酵的异常现象
（一）种子培养的异常现象 （二）发酵的异常现象
（一）种子培养的异常现象
1、菌体生长缓慢 原因：种子质量差、培养基成分不稳定、
培养条件没有控制到位。 2、菌丝结团 原因：种子、培养条件、培养基。 3、代谢不正常 原因：培养基不合适、培养环境不良、接
（2）措施：检查无菌空气、管道是否渗 漏。搅拌设备是否正常运行等。
4、泡沫过多
发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。 （1）原因：种子过嫩或过老，致使菌体生
长差、代谢速度慢，蛋白质胶体物质多。 培养基灭菌温度过高或时间过长，培养基
成分受到破坏。 （2）措施：接种优质种子、对培养基进行
合理灭菌。
（1）原因：培养基原料差、灭菌不彻底、加糖过 于集中等。
（2）措施：可通过加酸或碱调节。最好加入一些 生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。
3、溶氧水平异常（p164）
正常发酵过程的溶氧水平是由一定规律的 。如果溶氧水平与一般规律不一致即发生 了异常变化。
（1）原因：染菌。染菌的种类：好氧菌 、厌氧菌。菌体代谢异常、某些设备或工 艺发生故障或变化。
（二）染菌原因及分析
归纳发酵中染菌的主要原因有以下几方面： 无菌空气带菌、设备渗漏、种子带菌、灭菌
不彻底、操作失误和技术管理不善等。 但还要具体问题具体分析。可从污染的杂菌
种类、污染的时间、污染的程度等方面进行 综合分析，才能作出正确的判断，从而采取 相应的对策和措施。（p186-188）
1、染菌的杂菌种类分析
底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量 ，先将灭菌的底层培养基溶后倒平板，凝固后 ，将上层培养基溶解并保持40℃，加生长菌作 为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板 上，置培养箱保温经12～20h观察有无噬菌斑。
（四）发酵过程的异常现象观察法 （p186）
如可从溶解氧、pH值、排气中CO2含量、 菌体酶活力等变化来判断。
。 微生物的浓度过高，发酵液过浓： （1）原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发
酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。 （2）措施：补入大量的水。
二、染菌检查（p185-186）
在发酵过种中，对杂菌污染的及早发现、 及时处理，是免除染菌造成严重损失的重 要手段。因此，要求有确切、迅速的方法 来检测出污染的杂菌。
第七章-发酵染菌与防治
几个问题：
1、染菌 2、染菌途径 3、染菌检查的方法 4、染菌防治的方法
发酵染菌防治的意义：
现代发酵利用的是微生物的纯培养技术。 要严格无菌操作技术。
防止发酵过程中的染菌有着重要的意义： 保证产品的质量、收率的稳定。 保证发酵生产的有序进行。 有利于节约型社会的建立。
。 （2）部分发酵罐 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵后期：中间补料染菌、补料管渗漏。 （3）个别发酵罐染菌 一般原因是设备渗漏造成的。
3、不同污染阶段分析
1、溶解氧水平异常变化显示染菌。 2、pH异常变化显示染菌。 3、排气中CO2异常变化显示染菌。
谷氨酸正常发酵和异常发酵溶氧水平曲线：
三、发酵染菌的原因
（一）发酵染菌率
是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比 。
发酵染菌批数
总染菌率=——————100％
总投料批数
发酵染菌率是指在发酵罐中发生的染菌率，包括染 菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的 染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。
杂菌不同染菌的原因不同：（p187）
杂菌
原因
耐热的芽孢杆菌 养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角
球菌、无芽孢杆菌等真菌 设备渗漏、无菌操作不当、培养
基灭菌不彻底等
2、发酵染菌规模的分析
（1）大批发酵罐染菌 A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。 B发酵中后期：如是同一种菌则是无菌空气出问题
种量少、污染杂菌。
（二）发酵的异常现象（p184-185）
1、消耗缓慢（菌体生长差）
（1）原因：产生菌孢子和种子质量不好、发酵条 件差、培养基质量差（灭菌不当）等。
（2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发 酵温度。
2、pH异常
发酵过程中一般pH是有一定规律的。如不符合规 律则是发酵异常。
5、菌体浓度过高或过低
由于温度、氧气、培养基、种子质量、菌体自溶等影响微生 物的生长，或感染噬菌体等，导致发酵液中微生物的浓度过 高或过低。
微生物的浓度过低，发酵液转稀： 指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。 （1）原因：感染噬菌体、培养条件不合适。 （2）措施：防噬菌体、控制合适培养条件。 未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可
无菌空气的检查:将葡萄糖酚红肉汤培养基装在吸气 瓶中，灭菌后，37℃培养24h，若培养液未变浑浊 ，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，把过滤后的空 气引入吸气瓶中，培养后，若培养液变混或变黄色 ，表明空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题。
2、应用
（1）空气过滤系统。 （2）液体培养基。 （3）噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。