组织化学技术(孟)

苏丹Ⅲ染色法
作用原理 苏丹染色脂肪的机制一般认为是物理学上的
溶液作用或吸附作用。 苏丹Ⅲ染液的配制
苏丹Ⅲ0.2～0.3 g溶于70%酒精100 ml，放置
600C温箱中1小时，冷后过滤，用时取20 ml加蒸馏水2～3 ml；
操作程序
（1）取新鲜组织于10%甲醛固定，冰冻切片； （2）经50%酒精数分钟； （3）入苏丹Ⅲ染色液中15～30分钟（56～600C）； （4） 50%～70%酒精洗片刻，蒸馏水洗； （5）Hansen氏苏木精染细胞核，水洗； （6）纯甘油透明，湿性封片。 2．结果 脂肪呈深桔黄色，细胞核蓝色，胆脂素呈淡红 色，脂肪酸不染色。此方法为最常用的脂肪染色法，对 各种组织均适用。
1．酶的分类
水解酶 即催化水解反应的酶，它们是藉水的有或无以催 化水解底物的反应。如磷酸酶、酯酶、肽酶等。 氧化还原酶 是催化氧化-还原反应的酶类。包括脱氢酶、 氧化酶、过氧化物酶和单氧酶。其中脱氢酶催化底物脱氢，如 琥珀酸脱氢酶；氧化酶是直接或间接藉氧催化接受电子的酶， 如细胞色素氧化酶。 转化酶 催化功能基团部分分子转移形成另一新化合物的酶。 连接酶 又称合成酶，藉两个其它分子共同结合催化形成新 分子。 裂解酶 促进一种化合物分成两种化合物，或由两种化合物 合成一种化合物的酶类。 异构酶 催化同分异构体的相互转化。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属
沉淀的钙钴法。
Gomori-Takamatsu法
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
新鲜小块组织固定于10%的甲醛溶液8小时；入 70%丙酮1小时，纯丙酮30分钟；经二甲苯透明，石 蜡包埋，切片5 um；脱蜡经丙酮至水，入过氧化物 酶作用液5分钟； 联苯胺 100 ml 80%甲醇 25 ml 3%过氧化氢 2滴 用前加1~2倍蒸馏水稀释，保存于暗处。 蒸馏水速洗，入Harris苏木精2分钟，水洗，入依红 染20秒钟；脱水、透明、封片。 结果： 过氧化酶呈蓝色颗粒。
（二）多糖类
凡化学结构上含有糖分子的物质都称多糖类。多糖类物 质分布很广，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白 和糖脂类。在机体内很多组织，如肝、肌肉、消化道、呼吸 道和唾液腺的上皮粘液、甲状腺滤泡胶质、软骨基质、垂体 嗜碱性细胞、基底膜、真菌、纤维蛋白、胶原纤维和中枢神 经系统等都含有糖。 有较多的方法可以显示多糖类的成分。最常用的有：
的科学。
二、组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年 来已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸 与蛋白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化 合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化 学、电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、 同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学 和放射自显影技术等。因此，现代组织化学的概念已 经大大的超过了以往的范畴，无论从理论、内容、研 究手段和研究范围都比以往更广泛及更深入。
硫化氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过
50ml蒸馏水中，每分钟通过120个气泡的速度，10分钟即可。
染色方法
①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片；
②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不 同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅； ④切片入硫化氢液10～60s；
⑤充分蒸馏水洗；
2．酶的组织化学反应法
⑴ 偶氮染料法 酶的活性使一部分萘酚释放，重氮盐与萘酚结合， 形成的反应产物成为不溶性偶氮染料，其显示处即标志出酶的活性所在。 重氮盐是原发性芳香族胺与亚硝酸的反应产物经重氮化作用过程所形成。 ⑵ 吲哚酚法 酶活性促使吲哚酚底质释放吲哚基并很快被氧化为不 溶性靛蓝最终产物。 ⑶ 金属-金属盐法 金、银、铜、铁、铝和钴等金属盐及其化合物 都具有颜色，容易发生呈色反应。酶的分解产物和金属一般都可以结合。 因此，酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团与金属离子结合而沉淀， 最后使酶的活性所在处形成不溶性的有色盐。 ⑷ 氧化-还原反应法 在氧化还原反应后，氢被从某物质移除（氧 化作用），转移到另一物质（还原作用）。如氧化酶的显示是酶的活性催 化底物将氢转移到四唑盐，使之还原成为非水溶性甲色素于该酶活性所在 处。 ⑸ 色素形成法 色素形成法是显示酶定位的反应法。
过碘酸-Schiff反应
PAS—阿尔辛蓝法
过碘酸-Schiff反应
作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-
Schiff反应（PAS反应）来显示。其原理是通过过
碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出
醛基，与无色碱性品红反应显示出红色。
试剂配制
① 过碘酸氧化液 溶后冰箱中待用。 ② Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液
组织化学技术概述
组织学与胚胎学教研室
孟运莲 教授
提纲
一、组织化学的定义
二、组织化学的研究概况
三、组织化学研究的内容
（一）酶 （二）多糖 （三）脂肪 （四） 核酸
（五） 蛋白质
一、组织化学的定义
组织化学是运用物理学、化学、免疫学和分
子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、 化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究
碱性磷酸酶
+Ca2+
甘油磷酸酯
硫化钴（黑色）
磷酸酯
磷酸钴
磷酸钙
+Co2+
试剂配制 ① 作用液 2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml 3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
本液PH值为9．4。
蒸馏水5ml
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
染色方法
① 将未固定的组织在恒冷切片机切片； ② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片， 37℃， 10min （切片8μm厚）； ③ 流水冲洗5min； ④ 入2%硝酸钴溶液中5min； ⑤ 蒸馏水洗； ⑥ 入0.5%的硫化氨液1min；
⑦ 蒸馏水洗；
⑧ 甘油明胶液封固。 （4）结果 硫化钴的黑色沉淀表示酶活性。 幻灯片 15
3．介绍几种常用的酶组织化学Байду номын сангаас
⑴ 酸 性 磷 酸 酶 （ Acid Phosphatase , ACP ） 广泛分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有
少量在内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状
缘、肝、脾、肾及肾上腺等尤为丰富。
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸

电 子 显 微 镜 组 织 化 学 技 术 (electron microscopic histochemical technics) ， 是 在 电 镜下观察所显示的化学物质，以电子密度 (ectron
dendity)高或低来表明其含量。

光镜和电镜组织化学，均可对所显示的化学物
质进行定位、定性和定量观察。
⑶琥珀酸脱氢酶（SDH）是属于琥珀酸氧化酶系统的酶，
也是普通的酶类之一，是三羧酸循环中一个很重要的酶。它不 需要辅酶的存在，便可催化琥珀酸盐脱氢后转变为延胡索酸， 琥珀酸脱氢酶存在于所有有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小 管曲部上皮细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜 内，最适PH值为7.6。此酶对固定剂很敏感，因此，要求新鲜 组织低温恒冷切片。 Nachlas硝基蓝四唑法结果 琥珀酸脱氢酶活性部位呈蓝
酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后者与高浓度的 Pb2+ 结合，形成无色的磷酸铅，经硫化胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
酸性磷酸酶
甘油磷酸酯
磷酸酯+铅
磷酸铅
硫化铅
试剂配制
①孵育液 在400ml0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入 0.53g 硝酸铅及 40ml3% 的β- 甘油磷酸钠溶液，在 37℃放置24h 产生一些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。 ②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的
先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱
性复红，再煮沸1min。冷却至50℃加入20ml1N盐酸， 待35℃时加入2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍 带红色，5h之后变为无色液体。棕色瓶内装好，封口， 放入冰箱中保存待用。
染色方法
① 组织切片，脱蜡至水； ② 蒸馏水洗；③ 入过碘酸氧 化液 10 ～ 20min ；④ 充分蒸馏水洗；⑤ Schiff 液染色 10min （如果室温在15℃以下可稍加温以加快反应）；⑥ 流水冲洗 10min（对着色较深颜色的切片可缩短时间）。⑦ 可用Mayer
注意事项
① 不纯的二甲苯对硫化钴有分解作用，导致阳性结果慢慢褪色。因此用 于透明的二甲苯应用AR级。 ② 组织固定必须在4℃冰箱内进行，固定时间不要超过24h，否则酶活性 减弱至逐渐消失。在用石蜡包埋时，蜡箱的温度不能高于 56℃。应用熔 点为52℃～54℃的石蜡进行浸蜡，浸蜡时间尽量减短，否则使酶活性处 于长时间高温的环境中，大量的酶被破坏而消失。 ③ 孵育液要保存于冰箱内，用前取出，并提前放入温箱使之达37℃，然 后再把切片放入孵育。孵育后可放回冰箱，此液可使用数次。 ④ 硫化铵-丙酮液每次使用时应新鲜配制，配后数小时至1日后则应弃去， 如需用时可再重新配制。 ⑤ 钙钴法对组织内的含铁血黄素与钙盐也可形成棕黑色沉淀，与碱性磷 酸酶的阳性反应相似，容易混淆，必要时作铁反应和钙盐检测。
味的药品。
③ 染了Schiff液后，不可用自来水冲洗过久，防止返红。应
注重切片变红适中后立即封片。