组织化学技术概述 ppt课件
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生物显微技术 第三章 细胞化学和组织化学
❖ 显示脂类的基本原理 ：用易溶于脂类的染料, 使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的 脂类着色.
❖ 常用方法： 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩
❖ 常用方法： 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩
组织化学技术
组织化学技术切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
一、染色的目的任何冰冻切片、石蜡切片等如果不经过染色，在显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓，即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能观察到一些组织结构，但也是极其简单有限的，远不能满足观察和借以诊断的目的。
染色的目的，是将染料配制成溶液，将组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，使组织或细胞及其他异常的成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，便于在光学显微镜下进行观察。
因此，染色在组织形态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工作中，都具有非常重要的意义和实用价值。
二、染色的原理染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程。
有关两者结合的原理，有不同的学说，一般认为其过程是化学反应和物理现象。
（一）染色的化学反应在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别，酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合，碱性物质部分能与溶液中的阴离子结合。
在细胞核中，特别是核内染色质，一般有酸性物质组成（其中主要有核酸），故与碱性染料的亲和力很强，易于染色，以氧化苏木素代表的碱性染料中有染色作用的是阳离子。
在细胞浆中则由碱性物质组成，所以胞浆与酸性染料有较强的亲和力，以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的是阴离子。
(二) 染色的物理作用1. 毛细作用及渗透作用组织有许多小孔，染料因渗透作用进入组织，它与组织没有牢固的结合，所以是单纯的物理作用，不能称为直接染色作用。
因所谓染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳固的结合。
2. 吸收或溶液作用组织吸收染料，作牢固的结合，组织的着色与溶液颜色相同，但不是和干燥染料的颜色相同。
如复红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的复红带绿色。
3. 吸附作用吸附作用是固体物理的特性，它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒，这些微粒可能是溶于溶液中的化合物，也可能是只在溶液中单独存在的离子，如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
组织化学技术教程PPT课件
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案例一：乳腺癌组织化学染色分析
总结词
乳腺癌组织化学染色分析是研究乳腺癌的重要手段， 通过染色技术观察癌细胞形态和组织结构变化，有助 于诊断和预后评估。
详细描述
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，组织化学染色分析可 以帮助医生了解癌细胞的分化程度、恶性程度以及转 移情况。在染色过程中，常用的染色方法包括HE染色 、免疫组化染色和特殊染色等。通过观察癌细胞核增 大、核沟、核沟蛋自质等特征，可以判断癌细胞的恶 性程度和分化程度。此外，组织化学染色还可以用于 检测癌细胞转移和浸润的情况，为临床治疗提供依据 。
组织化学技术教程
目录
• 组织化学技术概述 • 组织化学技术的基本原理 • 组织化学技术的实际应用 • 组织化学技术的挑战与未来发展 • 案例分析
01 组织化学技术概述
定义与特点
定义
组织化学技术是一种利用化学反应来 检测组织或细胞内特定化学物质的方 法。
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分析、 可定位分析等。
20世纪初
随着新技术的不断涌现，组织 化学技术得到迅速发展，并逐 渐应用于医学领域。
20世纪中叶
随着免疫组织化学和原位杂交 技术的出现，组织化学技术进 入了一个新的发展阶段。
21世纪
随着Байду номын сангаас白质组学和基因组学研究 的深入，组织化学技术在生命科
学领域的应用越来越广泛。
02 组织化学技术的基本原理
组织样本的获取
解决方案
针对这些挑战，可以采取优化实验条件、改进抗体标记技术、发展新型荧光染料 和探针等措施，提高检测的灵敏度和特异性。同时，加强样本处理和数据分析方 法的研究，提高实验结果的可靠性和可重复性。
《免疫组织化学技术》PPT课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组织化学技术-PPT精选文档
3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在 荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发 光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中 某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光 技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊 断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶 的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于 光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
4、被检测的物质
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、 多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病 原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA的异同
1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗 原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品 内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能 更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通 过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量 ，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组 化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原 结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。 与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首 选方法之一。
免疫组化及特殊染色ppt课件
免疫组化及特殊染色
6
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
免疫组化及特殊染色
20
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
5
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
3
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
组织化学技术教程
第三章 组织化学的基本技术
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
【检验医学】免疫组织化学技术
➢ 固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质 及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂
各种抗原的固定
抗原 蛋白质 微生物 病毒外壳 多糖 黏液物质 类脂质
固定剂或处理方法 乙醇、甲醇 丙酮、三氯化碳 胰蛋白酶 10%甲醛或微火加热 透明质酸酶 乙醚、丙酮
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。
四、结 果 判 断
➢ 对照实验： 阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈 阴性结果时更为重要） 阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）
➢ 确证实验： 空白实验：PBS（排除内源性酶） 替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗 原引起的非特异性反应） 吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的 标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原 抗体反应。）
第十二章 免疫组织化学技术
概念
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测 定的一项免疫检测方法。
第一节 免疫组织化学技术概述
根据标记物的不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术
第一节 免疫组织化学技术概述
免疫组织化学的基本过程包括：
1.抗原的提取与纯化； 2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及
抗体的纯化； 3.将标记物与抗体结合形成标记抗体； 4.标本的处理与制备； 5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应； 6.观察结果。
各种抗原的固定
抗原 蛋白质 微生物 病毒外壳 多糖 黏液物质 类脂质
固定剂或处理方法 乙醇、甲醇 丙酮、三氯化碳 胰蛋白酶 10%甲醛或微火加热 透明质酸酶 乙醚、丙酮
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。
四、结 果 判 断
➢ 对照实验： 阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈 阴性结果时更为重要） 阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）
➢ 确证实验： 空白实验：PBS（排除内源性酶） 替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗 原引起的非特异性反应） 吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的 标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原 抗体反应。）
第十二章 免疫组织化学技术
概念
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测 定的一项免疫检测方法。
第一节 免疫组织化学技术概述
根据标记物的不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术
第一节 免疫组织化学技术概述
免疫组织化学的基本过程包括：
1.抗原的提取与纯化； 2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及
抗体的纯化； 3.将标记物与抗体结合形成标记抗体； 4.标本的处理与制备； 5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应； 6.观察结果。
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分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有少量在 内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状缘、肝、 脾、肾及肾上腺等尤为丰富。
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11
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理
试剂配制
染色方法
对照
ppt课件
结果
12
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸 酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后 者 与 高 浓 度 的 Pb2+ 结 合 ， 形 成 无 色 的 磷 酸 铅 ， 经 硫 化 胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
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16
碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase , ALP）广泛存在
于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血 管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾 上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属沉淀的钙 钴法。
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3
应用组织化学技术（histochemical technics）,显示组 织细胞内的各种化学物质和代谢状态。光镜组织化学技 术(microscopic histochemical technics)所显示的组织化学 物质，是呈色反应(staining rection)，呈色反应的强或弱， 表示组织细胞内化学物质含量的多少。酶组织化学 (enzyme histochemical )，所显示酶的呈色反应的强或弱， 也称酶活性反应(enzyme active rection)。光学显微镜下
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17
Gomori-Takamatsu法
作用原理
试剂配制
染色方法
结果
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注意事项
18
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
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14
染色方法
①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片；
②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅；
④切片入硫化氢液10～60s； ⑤充分蒸馏水洗；
⑥在甘油明胶封固剂中封固。
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15
对照片 在孵育液中加入0.01M氟化钠。
结果 硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀
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7
（一）酶的分类 1． 水解酶 2． 氧化还原酶 3． 转化酶 4．连接酶 5． 裂解酶 6． 异构酶
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8
（二）酶的组织化学反应法
1． 偶氮染料法 2． 吲哚酚法 3． 金属---金属盐法 4．氧化-还原反应法 5．色素形成法
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9
酶类
酸性磷酸酶
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
甘油磷酸酯酸性磷酸酶磷酸酯+铅
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磷酸铅
硫化铅
13
试剂配制
①孵育液 在400ml0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入0.53g 硝酸铅及40ml3%的β-甘油磷酸钠溶液，在37℃放置24h产生一 些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。
②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的硫化 氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过50ml蒸 馏水中，每分钟通过120个气泡的速度10min即可。
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20
染色方法
① 将未固定的组织在恒冷切片机切片；
② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min （切片8μm厚）；
③ 流水冲洗5min；
④ 入2%硝酸钴溶液中5min；
甘油磷酸酯 碱性磷酸酶 磷酸酯 +Ca2+ 磷酸钙 硫化钴（黑色） 磷酸钴
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+Co2+ 19
试剂配制
① 作用液
2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml
3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
蒸馏水5ml
本液PH值为9．4。
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
组织化学技术概述
(人体解剖与组织胚胎学系)
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1
一.组织化学的定义
组织化学（histochemistry）技术是通过化学 或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学 成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
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2
二.组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年来
已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸与蛋 白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与 粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学、电镜 组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织 化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影 技术等。因此，现代组织化学的概念已经大大的超过了 以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围 都比以往更广泛及更深入。
所见的组织化学呈色反应也称阳性反应(positive rection)。
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4
电子显微镜组织化学技术(electron microscopic histochemical technics)，是在电 镜观察时，所显示的化学物质，呈现出的电
子密度(ectron dendity)高或低即表明所含量的 程度，或酶的活性强、弱。光镜和电镜组织
Gomori与McDonedel硫化铅法
碱性磷酸酶 Gomori-Takamatsu法
Байду номын сангаас
Gomori改良钙钴法
Gomori萘酚磷酸酯法
琥珀酸脱氢酶 Nachlas硝基蓝四唑法
Pearson二甲亚砜法
过氧化物酶 Graham-Karnovsky法
Vitale辣根过氧化物酶
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10
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase , ACP）广泛
化学，均可对所显示的化学物质和酶类，在
组织细胞内，进行定性、定量和定位观察。
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5
三.组织化学研究的内容
酶类、糖类、脂肪、核酸、蛋白质等
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6
酶（Enzyme）
酶（Enzyme）是具有催化功能的一种特殊蛋白质，人 体的各种机能活动都与酶的活性有密切关系，生物体内的一 切新陈代谢活动都是在酶的催化作用下进行的。因此，酶在 机体内的各种反应和鉴定手段涉及到各种基础学科，如组织、 生理、生化和病理等已成为日益为人们所重视的内容之一。
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11
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理
试剂配制
染色方法
对照
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结果
12
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸 酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后 者 与 高 浓 度 的 Pb2+ 结 合 ， 形 成 无 色 的 磷 酸 铅 ， 经 硫 化 胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
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碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase , ALP）广泛存在
于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血 管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾 上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属沉淀的钙 钴法。
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3
应用组织化学技术（histochemical technics）,显示组 织细胞内的各种化学物质和代谢状态。光镜组织化学技 术(microscopic histochemical technics)所显示的组织化学 物质，是呈色反应(staining rection)，呈色反应的强或弱， 表示组织细胞内化学物质含量的多少。酶组织化学 (enzyme histochemical )，所显示酶的呈色反应的强或弱， 也称酶活性反应(enzyme active rection)。光学显微镜下
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Gomori-Takamatsu法
作用原理
试剂配制
染色方法
结果
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注意事项
18
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
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染色方法
①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片；
②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅；
④切片入硫化氢液10～60s； ⑤充分蒸馏水洗；
⑥在甘油明胶封固剂中封固。
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对照片 在孵育液中加入0.01M氟化钠。
结果 硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀
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（一）酶的分类 1． 水解酶 2． 氧化还原酶 3． 转化酶 4．连接酶 5． 裂解酶 6． 异构酶
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（二）酶的组织化学反应法
1． 偶氮染料法 2． 吲哚酚法 3． 金属---金属盐法 4．氧化-还原反应法 5．色素形成法
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酶类
酸性磷酸酶
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
甘油磷酸酯酸性磷酸酶磷酸酯+铅
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磷酸铅
硫化铅
13
试剂配制
①孵育液 在400ml0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入0.53g 硝酸铅及40ml3%的β-甘油磷酸钠溶液，在37℃放置24h产生一 些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。
②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的硫化 氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过50ml蒸 馏水中，每分钟通过120个气泡的速度10min即可。
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20
染色方法
① 将未固定的组织在恒冷切片机切片；
② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min （切片8μm厚）；
③ 流水冲洗5min；
④ 入2%硝酸钴溶液中5min；
甘油磷酸酯 碱性磷酸酶 磷酸酯 +Ca2+ 磷酸钙 硫化钴（黑色） 磷酸钴
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+Co2+ 19
试剂配制
① 作用液
2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml
3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
蒸馏水5ml
本液PH值为9．4。
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
组织化学技术概述
(人体解剖与组织胚胎学系)
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1
一.组织化学的定义
组织化学（histochemistry）技术是通过化学 或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学 成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
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2
二.组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年来
已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸与蛋 白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与 粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学、电镜 组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织 化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影 技术等。因此，现代组织化学的概念已经大大的超过了 以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围 都比以往更广泛及更深入。
所见的组织化学呈色反应也称阳性反应(positive rection)。
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4
电子显微镜组织化学技术(electron microscopic histochemical technics)，是在电 镜观察时，所显示的化学物质，呈现出的电
子密度(ectron dendity)高或低即表明所含量的 程度，或酶的活性强、弱。光镜和电镜组织
Gomori与McDonedel硫化铅法
碱性磷酸酶 Gomori-Takamatsu法
Байду номын сангаас
Gomori改良钙钴法
Gomori萘酚磷酸酯法
琥珀酸脱氢酶 Nachlas硝基蓝四唑法
Pearson二甲亚砜法
过氧化物酶 Graham-Karnovsky法
Vitale辣根过氧化物酶
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10
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase , ACP）广泛
化学，均可对所显示的化学物质和酶类，在
组织细胞内，进行定性、定量和定位观察。
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5
三.组织化学研究的内容
酶类、糖类、脂肪、核酸、蛋白质等
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6
酶（Enzyme）
酶（Enzyme）是具有催化功能的一种特殊蛋白质，人 体的各种机能活动都与酶的活性有密切关系，生物体内的一 切新陈代谢活动都是在酶的催化作用下进行的。因此，酶在 机体内的各种反应和鉴定手段涉及到各种基础学科，如组织、 生理、生化和病理等已成为日益为人们所重视的内容之一。