非变性凝胶电泳技术

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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理,步骤和结果分析

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理，步骤
和结果分析
一、实验原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理基于蛋白质在凝胶电泳过程中受到凝胶孔隙大小及电场力的影响而发生迁移分离。

在非变性条件下，蛋白质保持其原有的构象，通过电泳进行分离。

二、实验步骤
1. 制备凝胶：首先准备非变性聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过聚丙烯酰胺单体聚合成凝胶板。

2. 样品加载：将待分离的蛋白样品混合添加载体缓冲液，并加热变性处理，然后加载到凝胶槽中。

3. 电泳分离：将已加载样品的凝胶槽浸入电泳缓冲液中，施加电场进行电泳分离，蛋白质根据其分子大小及电荷迁移至不同的位置，最终形成条带。

4. 凝胶染色：分离完成后，应用染色方法将蛋白质条带可视化。

5. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移位置以及染色效果，分析样品中含有的蛋白种类及相对含量。

三、实验结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们可以获得样品中蛋白质的分子量信息，并进一步分析样品中可能存在的杂质及纯度。

在电泳过程中，蛋白质根据其分子大小在凝胶中迁移的速度不同，从而实现了蛋白质的分离。

根据蛋白质在凝胶上的位置，我们可以对样品进行定性和定量分析，从而获得关于样品组成和含量的重要信息。

综上所述，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单有效的蛋白质分离技术，广泛应用于生物学和生物化学研究中。

通过实验结果的分析和解读，可以更好地了解样品中蛋白质的组成及结构，为进一步的实验研究提供重要参考。

蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展汇总.

一般认为自身带负电的考马斯亮蓝染料以约 1∶ 1 的比率结合在蛋白质复合体的表面使其带上负电。［16］这样既防止了电泳过程中因缺少去污剂导致的蛋白质复合体之间的聚集，又因屏蔽了蛋白质复合体的电荷使复合体在胶体内的迁移率只由分子量决定，进而提高了非变性凝胶电泳分离的分辨率［14］。同时考马斯亮蓝可以覆盖蛋白质表面的疏水基团，大大增加了疏水蛋白质的溶解性［17］。由于考马斯亮蓝染料能够结合到酸性氨基酸上，使一些碱性蛋白质如 pI = 10 7 的细胞色素 C 也同样可以在中性缓冲体系中向阳极迁移。［18］ BN-PAGE 电泳体系中除了引入考马斯亮蓝染料外，还常使用一些其它试剂来溶解复合体和维持复合体的完整性，如使用中性去污剂和两性离子 6-氨基己酸增加膜蛋白复合体的溶解性，使用 2，2-双二羟甲基苯胺（ BisTris）或者咪唑用来维持胶内 pH 值在 7 0 － 7 5 之间等［19］。
Meng Qingshi1，2 Zhang Guangxiang1 Pan Yinghong2
（ 1 College of Life Sciences，Sichuan Normal University，Chengdu 610101； 2 The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural，Beijing 100081）
张光祥，男，博士，副教授，从事分子生物学研究； E-mail： zhgx-163@ 163. com

凝胶电泳分离技术

之蔡仲巾千创作复杂体系的分离技术凝胶电泳分离技术凝胶电泳分离技术摘要：凝胶电泳（Gel electrophoresis）, 也可称为胶体电泳或扁平式电泳法.凝胶电泳分离技术用途非常广泛, 尤其是在生物学和化学的领域, 是用于分离分歧物理性质（如年夜小、形状、等电点等）的分子的技术, 一般可用于质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者免疫印迹检测之前来进行部份提纯分子.本文将通过对凝胶电泳分离技术的概念, 原理, 特点和应用四部份的简要介绍, 使读者对该技术有一定初步的了解.第一部份基本概念一、凝胶凝胶（gelatum）又称冻胶,是指溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接, 形成空间网状结构, 结构空隙中布满了作为分散介质的液体或气体, 这样一种特殊的分散体系称作凝胶.IUPAC给出的凝胶界说是非流动性的胶态网络或者是贯穿其整个体积由流体膨胀聚合物网络.（凝胶）凝胶是一种充沛稀释的交联系统, 在稳定状态下没有流动性.凝胶的主要成份是液体, 但由于液体中的三维交联网络, 凝胶在很多方面有着与固体相近的特性.凝胶可以包括共价聚合物网络结构, 氢键、结晶、螺旋结构, 玻璃状结构, 层状结构和微粒无序结构.凝胶可分为弹性凝胶和脆性凝胶, 弹性凝胶失去分散介质后, 体积显著缩小, 而当重新吸收分散介质时, 体积又重新膨胀, 例如明胶等；脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时, 形状和体积都不改变, 例如硅胶等.由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为胶凝作用.在凝胶电泳分离技术中, 凝胶作为分离分子的基质, 在分离卵白质或小的核酸（DNA、RNA、或寡核苷酸）的时候, 通常是用分歧浓度的丙烯酰胺和一个交联剂聚合而成, 形成份歧年夜小网眼的聚丙烯酰胺网状系统, 最初使用的凝胶是淀粉凝胶, 但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶.二、电泳电泳（electrophoresis）是在电场的作用下而发生的物质运动, 分歧的物质在一定的电场强度下, 由于所带电荷分歧, 因此受到的引力分歧, 向相反电极泳动速度分歧进而达到分离目的.原则上按电泳的原理来分, 可分为二类：（1）自由界面电泳, 又称移动界面电泳, （电泳原理示意图）是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳.其装置复杂, 价格昂贵, 费时费力, 方便于推广应用.（2）区带电泳：是指有支持介质的电泳, 待分离物质在支持介质上分离成若干区带.支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散, 以使被分离的成份获得最年夜分辨率的分离.按支持介质种类的分歧, 区带电泳可分为纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳.聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最经常使用的支持介质.在凝胶电泳分离技术中, 电泳是指在凝胶上用来推动或拉住分子的电动势.三、凝胶电泳凝胶电泳分离技术（Gel electrophoresis separation technique）是一种以具有网状多孔结构的凝胶为支持物的电泳技术.同时由于凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用, 因此有很高的分离能力.从凝胶层面上来看, 有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳, 从电场层面上来看, 有普通电场凝胶电泳和脉冲电场凝胶电泳.凝胶作为支持介质的引入年夜年夜增进了电泳技术的发展, 是我们人类对技术的综合利用, 自然成为分析卵白质、核酸等生物年夜分子的重要手段.第二部份基来源根基理将一种分子放置在电场傍边时, 它会以一定的速度移向适当的电极, 如果分子带负电多就会往氧化极移动, 带正电多就往还原极移动.电泳分子在电场作用下的迁移速度, 叫做电泳的迁移率, 它同电场的强度和电泳分子自己所携带的净电荷数成正比. 由于在凝胶电泳分离技术中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质, 如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等, 从而降低了扩散和对流运动, 因此电泳的迁移率与分子的年夜小和缓冲液的粘度成反比.根据以上因素我们可以通过电泳将卵白质或核酸分子混合物中的各种成份彼此分离开来.核酸分子的糖—磷酸骨架中的磷酸基团带负电荷, 当核酸分子被放置电场中时, 它们就会向正电极的方向迁移, 由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质, 相同数量的双链DNA 几乎具有等量的V ：泳动速度cm/秒或分 u ：泳动率或泳动度（cm/伏.秒或分）U ：电压常压（100-500v ）高压（500-1000v ）仅需几分钟】t:电泳时间（秒或分） d:泳动距离cm E:电场强度 v/cm l:支持场的有效长度cm净电荷, 因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移, 分子量较小的DNA分子比分子量较年夜的DNA分子迁移要快些.卵白质有分歧的电荷和复杂的形状, 当放电动势在样品上, 卵白质可能会以分歧的速度进入凝胶或完全不移动, 而卵白质在有洗涤剂如十二烷基硫酸钠或十二烷基磷酸钠呈现时会变性, 洗涤剂会以负电荷覆盖卵白质, 所以键结后蜕变的卵白质带有负电荷, 而且所有卵白质有相似的“荷质比”（电荷和质量的比值）.在跑完电泳, 最小的分子几乎都达到氧化极之后, 可以对凝胶里的分子染色, 这样才华看到分子.可以用溴化乙锭, 银或考马斯亮蓝染色, 也可以用其他方法看到凝胶里分离后的混合物组成, 如果分析物的分子在紫外线下会发光, 就可以在紫外线下拍出凝胶的照片, 如果要分离的分子有放射性原子, 就可以用同位素示踪剂记录.如果一开始有很多个混合物一个接一个注入相邻的“井”, 跑出来的结果会是一条一条平行的轨迹.根据分歧分子的数量, 每一条轨迹都有一条或以上, 明显的亮带, 暗示原本混合物分离出来的组成, 每个亮带代表一个组成, 组成物分离不完全就会跑出重叠的亮带, 或者难以分辨的污点就暗示许多组成物没有分解.第三部份特点凝胶电泳的电泳迁移率是指在单元电场强度时带电分子的迁移速度, 而迁移率与带电分子所带静电荷和所处电场电场强度成正比, 与分子的年夜小和缓冲液的摩擦系数成反比.（一）电场强度电场强度是指单元长度的电位降, 也称电势梯度.电场强度愈年夜, 带电颗粒的泳动越快.但凝胶的有效分离范围随着电压增年夜而减小.（二）样品的物理性质（1）分子年夜小当核酸分子年夜小超越20kb时, 普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开, 此时电泳的迁移率与分子年夜小无关.（2）分子空间构型当分子空间构型分歧, 其迁移率也分歧.（3）分子带电量分歧核酸分子的电荷密度年夜致相同对迁移率影响不年夜.（4）分子碱基组成分歧核酸分子碱基组成对迁移率影响不年夜.（三）支持物的物理性质凝胶浓度越小, 孔径越年夜；浓度越年夜, 孔径越小.琼脂糖是线性多聚体年夜分子, 含有分歧浓度琼脂糖的凝胶构成份子筛的网孔年夜小分歧, 适于分离分歧浓度范围的核酸分子.聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺在交联剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶, 其网孔的年夜小由两物质的相比较例决定.第四部份应用一、琼脂糖凝胶电泳（一）简介琼脂糖主要从琼脂中提取而来并经糖基化修饰, 是一种聚合链线性分子, 琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布, 当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接, 形成孔径结构, 并随着琼脂糖浓度分歧形成份歧年夜小的孔径.（琼脂糖结构式）使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质, 发挥分子筛功能, 物质分子通过会受到阻力, 年夜分子物质在泳动时受到的阻力年夜, 因此在凝胶电泳中, 带点颗粒的分离不单取决于净电荷的性质和数量, 而且还取决于分子的年夜小, 这就年夜年夜提高了分辨能力.根据相关性质, 可以分为：（1）低熔点凝胶, 用于DNA片段的回收、酶切、连接等.（2）高熔点凝胶, 用于分离小于1kb的DNA片段, PCR产物的分析.（3）快速凝胶, 电泳速度较快, 节省实验时间.（4）其他类型, 依据机械强度和熔点选择.（二）特点（1）凝胶结构均匀, 孔径较年夜, 可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等年夜分子物质.（2）把持简单、快速, 通过调整其使用浓度, 使得分辨率可以达到年夜大都实验的要求, 成为分离、鉴定、纯化核酸分子的经常使用方法.（3）琼脂糖凝胶因不含硫酸根和羧基, 几乎消除琼脂的电渗.（4）对卵白质吸附极微, 故无拖尾现象.（5）透明度较好, 可直接或干燥成薄膜后进行染色.（6）不吸收紫外光, 可直接利用紫外光吸收法作定量测定.（7）机械强度差, 易破碎, 浓度不能太低, 易被细菌污染, 不容易保管.二、聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）（一）简介聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的年夜分子.带有酰胺侧链,没有或很少有带离子的侧基,因而电渗作用比力小, 不容易和样品相互作用.根据凝胶溶液和电泳缓冲液对卵白质构象的影响, 可分为两种方式:一是非变性聚丙烯酰胺凝胶, 在电泳的过程中, 卵白质能够坚持完整状态, 并依据卵白质的分子量年夜小、卵白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开, 在未变凝胶中分离DNA的缺点是DNA 的迁移率受碱基组成和序列的影响.由于无法得知未知 DNA的迁移是否反常, 故不能用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定分子的年夜小.二是用于分离及纯化单链DNA 片段的变性聚丙烯酰胺凝胶.这类凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）的存在下聚合而成的.变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关, 故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等.（二）特点（1）具有分子筛效应, 分辨率高（2）样品不容易扩散, 用量少, 灵敏度可达10（3）化学性质稳定, 分子结构中富含酰胺基, 具有稳定的亲水基团（4）凝胶不带电荷, 消除电渗现象（5）机械强度好, 有弹性, 在一定浓度范围内无色透明（6）网孔可调节（三）十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）仅根据卵白质亚基分子量的分歧就可以分开卵白质.该技术最初由Shapiro 于1967年建立, 他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后, 卵白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的年夜小（可以忽略电荷因素）.十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂, 在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在.这种阴离子去污剂能破坏卵白质分子间以及与其他物质分子间的非共价键, 使卵白质分子的二硫键被还原剂翻开其实不容易再氧化, 这就保证了卵白质分子与SDS充沛结合从（SDS结构示意图）而形成带负电荷的卵白质-SDS复合物.卵白质分子与SDS结合后所带上的SDS负电荷年夜年夜超越了卵白质分子原有的电量, 因而也就掩盖或消除分歧种类卵白质分子间原有的电荷不同.这样的卵白质-SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受卵白质原有电荷和形状等因素的影响, 而主要取决于卵白质分子量年夜小.当卵白质的分子质量在15000-20000之间时, 电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系, 符合下列方程式：lgMw=-b.Mr+K.式中, MW为卵白质的分子量, mR为相对迁移率, b为斜率, K为截距, 在条件一按时, b和K均为常数.采纳SDS-PAGE系统作单向电泳, 不单可以根据分子量年夜小对卵白质进行分离, 而且可以根据电泳迁移率年夜小测定卵白质的分子量.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测, 纯化的卵白质通常在SDS电泳上应只有一条带, 但如果卵白质是由分歧的亚基组成的, 它在电泳中可能会形成份别对应于各个亚基的几条带.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度, 一般只需要不到微克量级的卵白质, 而且通过电泳还可以同时获得关于分子量的情况, 这些信息对了解未知卵白及设计提纯过程都是非常重要的.三、脉冲电场凝胶电泳（一）简介一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA, 这是因为在琼脂糖凝胶中, DNA分子的有效直径超越凝胶孔径时, 电场作用迫使DNA变形挤过筛孔沿着泳动方向伸直, 因而分子年夜小对迁移率影响不年夜, 此时凝胶介质的分子筛效应不明显.脉冲电场凝胶电泳是在琼脂糖凝胶上外加正交的交变脉冲电场, 其方向、时间与电流年夜小交替改变, 每当电场方向发生改变, 年夜分子的DNA便滞留在爬行管内, 直至沿新的电场轴向重新定向后, 才华继续向前移动, DNA分子越年夜, 这种重排所需时间就越长, 当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时, DNA就可以按其分子量年夜小分开, 因此分辨力较高, 是用于分离年夜分子量线状DNA分子的一种电泳方法.（二）应用（1）用于分离线状DNA, 从环状DNA中分离出线状DNA的技术称作脉冲场聚丙烯酰胺凝胶电泳, 先采纳在钳位均匀电场中的水平聚丙烯酰胺凝胶电泳, 后改在电场转凝胶电泳条件下的缓冲溶液非连续性垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳, 从而使分离简单, 有效.（2）用于分离EB病毒基因组, EB病毒不能在其转化的淋巴细胞中引起年夜量溶解性感染, 因此采纳惯例方法分离EB病毒DNA比力困难, 以往的分离方法需要从年夜量的部份感受态B-淋巴细胞培养物中增殖病毒粒子, 故分离到的纯EBDNA量很少, 采纳PFGE分离技术则能获得更多的量.（EB病毒）（3）用于研究年夜分子复合物如何形成生物系统, 通过提高成熟线形双链细菌DNA和体内外成熟细菌DNA末端连接复合物的分离长度, 提高细菌DNA环状形式的分离, 提高线状单链细胞DNA的分离, 提供分析卵白质-DNA复合物的相对简单的方法, 提供比液相阶段更为简单和有效的、对所有细菌DNA进行定量分析的固相阶段分析法来达到目的.（4）用于研究细胞凋亡, 因凋亡时DNA的降解先于细胞形态学的变动, 故敏感、特异地检测降解DNA的片段梯度被认为是检测细胞凋亡的标识表记标帜.四、不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳在有较高pH值的电泳胶聚合后, 在此基础上再制备一段低于pH值的年夜孔径聚积凝胶, 当给两极施加电场,缓冲离子从上方的缓冲液库向聚积凝胶迁移, 上方缓冲库中缓冲阴离子进入聚积凝胶后, 凝胶中的pH值比它们自身的pK值要低很多, 因此酿成电中性, 引起导电体的缺乏, 于是聚积凝胶中电阻增年夜, 年夜部份电场就加在聚积凝胶上, 招致卵白质分子在聚积凝胶中的迁移速度比在电泳胶中年夜很多, 致使所有卵白质分子在两种凝胶的界面上密集, 当低pH值的缓冲离子从聚积凝胶中迁出, 所有缓冲离子都是高pH值, 两种凝胶电阻率相同, 各种卵白质分子再同时从界面向正极迁移, 可使试样带变窄, 提高分辨率.五、等电点聚焦电泳（一）简介等电点聚焦是根据卵白质的净电荷或者等电点的分歧来进行分离, 将试样至于pH梯度的凝胶中, 卵白质在电场作用下沿着pH值梯度方向迁移, 当达到某一位置时, 在该pH条件下, 其净电荷为零, 因此不再移动, 由于许多卵白质都有其特定的等电点, 因而可将卵白质分离开来.丙酰胺衍生物作缓冲液可使梯度缓冲离子固定化, 其中R为羧酸基或季铵基, 每种缓冲液都有一特定的pK值, 衍生物与丙烯酰胺一起聚合, 在聚合之前和聚合过程中施加电场, 在电场的作用下各种缓冲液按pH值高低顺序自动排列成序, 这样在电场作用下, 各缓冲液按pK高低次第自动排列成pH梯度, 当整个凝胶聚合后, 各缓冲液被聚合到凝胶中而固化, 因而可利用pH梯度准确地分离具有分歧等电点的各种卵白质, 提高分辨率.高电场可提高等电点聚焦的分离效果, 但需要有效地散热, 在试样处置过程中, 要注意防止卵白质的任何化学组成或结构的改变, 以免引起等电点的移动.（二）特点（1）分辨率高, 区带清晰、窄, 加样部位自由, 重现性好, 可测定卵白或多肽的等电点.（2）需无盐溶液, 不适用于在等电点不溶解或发生变性的卵白.六、二维凝胶电泳二维凝胶电泳首先在第一维空间用等电点电泳区分等电点分歧的卵白质, 然后将色带切下放入十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶中将分子量分歧的卵白质区分开来, 等待一段时间让两种凝胶预先达到平衡, 再进行第二维电泳, 可分辨5000种左右的卵白质.七、双向凝胶电泳双向凝胶电泳技术是唯一一种可同时分离上千种卵白质的方法, 可承载几毫克卵白质样品, 将其分离成上千个卵白点.但传统的双向电泳技术存在局限性, 例如效率分歧造成胶与胶之间重复性差, 存在误差使得很难区分卵白点丰度的变动是来源于实验误差还是诱发发生的生物学变动, 难以将卵白质表达量的变动定量, 疏水性膜卵白以及高度酸性或碱性的卵白的溶解度差招致其在双向电泳第一向等电聚焦中难以溶解造成卵白质的损失, 高丰度卵白的静态范围超越了检测可能性的静态范围招致低丰度卵白难以检测, 单一分离难以应对年夜规模的卵白组学分析等.九、不同凝胶电泳不同凝胶电泳技术建立在双向电泳技术的基础上, 以在双向电泳前先对卵白样品进行荧光标识表记标帜为基础, 能够在同一块双向电泳胶中进行两个卵白质样品差此外检测与定量, 从而可以防止传统双向电泳技术胶与胶之间重复性差的缺陷.（荧光染料）由于荧光染料的敏感性及线性, 不同凝胶电泳技术与其他标准的染色技术相比具有更加精确的定量能力, 另外不同凝胶电泳技术不需要进行电泳后的固定或脱色过程, 可减少卵白质尤其是低分子量卵白质的损失, 而且可以在同一块凝胶中比力两个分歧的卵白样品, 胶与胶之间变动的影响完全消除, 使得卵白点荧光强度的不同是来源于生物学变动而非试验误差, 可信度增加.第五部份结论从以上分析中我们可以看出, 凝胶电泳是样品物质在凝胶上进行电泳的过程, 能用来分离鉴定小分子物质（如核苷酸、氨基酸和肽类等）和年夜分子物质（如核酸、卵白质以及病毒颗粒等）.凝胶电泳分离技术是依照物质的电荷几多和分子年夜小进行分离的.凝胶电泳的主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶.凝胶电泳分离技术具有以下特点：一、用途广泛, 对年夜部份高分子物质均可定性定量分离提纯.二、用量小, 平安经济.三、凝胶可控, 选择具有多样性.四、分子筛作用和电泳作用的结合, 分辨能力强.五、把持简单, 制备容易.目前, 科学家正在对积极研究探索凝胶电泳分离技术的其他特性, 相信未来其在生物化学、医学临床等其他方面会而获得更为广泛的应用.第六部份参考文献[1]《卵白质、凝胶电泳及其分析应用》, 陈丹华, 1995年03月[2]《琼脂糖凝胶电泳实验技术研究》, 黄永莲, 2009年06月[3]《聚丙烯酰胺凝胶电泳及其在食品检测中的应用》, 唐亚丽等, 2007年12月[4]《脉冲电场凝胶电泳及其应用》, 彭黎明等, 2000年6月[5]《生物化学技术原理及应用》, 赵永芳, 2002年07月第3版, 科学出书社[6]《分析化学中的分离方法》, 王应玮, 梁树权, 1988年03月第1版, 科学出书社[7][8]。

RNA凝胶电泳步骤及注意事项

R N A凝胶电泳步骤及注意事项内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）R N A凝胶电泳步骤及注意事项1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性，本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作原理和操作方法与步骤。

一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。

非变性电泳使用%%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。

只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。

因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。

在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。

琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。

四、实验步骤(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

(2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。

在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

(3)打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。

在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

试剂：(1)MOPS缓冲液(10*):L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) ，L NaAc, 10mol/L EDTA。

(2)上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,%溴酚蓝，%二甲苯蓝。

(3)甲醛。

(4)去离子甲酰胺。

v电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——%DEPC水冲洗。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。

在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。

然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。

随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。

蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。

这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。

1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。

是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。

这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。

Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。

在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。

但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。

并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。

1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。

sds page凝胶电泳原理

sds page作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。

在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。

十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验修改版

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液：1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）4、TEMED5、20-200 DNA marker实验步骤：1、配置10%的胶10ml：5.5 ml water3.3ml 30% Acrylamide1ml 10 ×TBE0.11ml APS（现配现用）0.01mlTEMED2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。

3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。

4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。

二银染实验银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加0.15ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将6g Na2CO3溶解于200ml ddH2O中，冷却至4℃，使用前加0.3ml37%甲醛溶液（通风厨中进行）30μl0.1M五水硫代硫酸钠；（0.1M Na2S2O3。

5H2O：将1.24g Na2S2O3。

5H2O溶于50ml ddH2O）。

放入冰箱中冷却到4摄氏度。

注意事项：1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；8、显色过程中盘中须轻轻摇动。

RNA凝胶电泳步骤及注意事项

R N A凝胶电泳步骤及注意事项IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】R N A凝胶电泳步骤及注意事项1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性，本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作原理和操作方法与步骤。

一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。

非变性电泳使用%%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。

只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。

因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。

在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。

琼脂糖，1XTAE 电泳缓冲液，μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。

四、实验步骤(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

(2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。

在实验台上再加入5μl1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

(3)打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。

在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

试剂：(1)MOPS缓冲液(10*):L吗啉代丙烷磺酸(MOPS)，LNaAc,10mol/LEDTA。

(2)上样染料：50%甘油，1mmol/LEDTA,%溴酚蓝，%二甲苯蓝。

(3)甲醛。

(4)去离子甲酰胺。

v电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——%DEPC水冲洗。

Native-PAGE原理及方法

Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。

未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。

一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。

分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。

酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。

工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。

非变性凝胶电泳

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析[转]2009-12-09 20:27Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。

实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。

一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。

分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。

工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。

Native-PAGE

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析[转] 2009-12-09 20:27Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。

实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。

一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。

分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。

工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。

DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤

D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤(总3页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。

2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。

3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。

二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。

2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。

3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。

4、37％甲醛。

三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。

室温凝固时间>1小时。

四、银染：1、固定液固定10m。

2、水洗2m x3次。

3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。

4、水洗 20秒x2次。

5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。

6、水洗若干次，终止显色。

电泳时间：150v x3h，溴酚兰的位置相当于40bp。

银染后胶面积将膨胀10％。

在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。

显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。

我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。

因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。

它利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，将蛋白质按照其分子量大小隔离出来。

与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在分离过程中保持蛋白质的天然构象和电荷状态，因此适用于研究酶的活性以及蛋白质与其他分子的相互作用等。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是基于蛋白质在凝胶中的迁移速率与其分子量成反比的关系。

通过将样品加入凝胶孔中，并通过电泳使蛋白质随电场迁移，可以将分子量较大的蛋白质沿着凝胶向电极缓慢迁移，而分子量较小的蛋白质则快速迁移。

最终，蛋白质会在凝胶中形成带状图案，从而实现它们的分离。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳需要准备一定数目的设备以及试剂。

其中最主要的试剂是聚丙烯酰胺凝胶，其通过自由基聚合反应形成一种网络结构，可将蛋白质分子固定在凝胶中，防止其沿着电场离开凝胶。

另外还需要一些缓冲液来调节电泳过程中的pH值和离子浓度，以防止蛋白质发生聚集现象。

此外，还需要电泳槽、电源、电极、样品载体等设备。

在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之前，需要对这些设备进行清洗和消毒，以保证实验结果的准确性和可靠性。

在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的分离主要依赖于凝胶的孔径大小和电荷性质。

凝胶的孔径大小决定了蛋白质进入凝胶的速率，同时也影响了蛋白质与凝胶网络之间的相互作用，从而影响蛋白质的迁移速率。

电荷性质主要指凝胶中的离子种类和浓度，以及pH值等因素，这些因素会影响蛋白质的电荷状态，从而影响其在凝胶中的迁移速率。

如果这些因素不合适，就可能导致蛋白质无法有效地分离。

总之，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。

通过调节凝胶孔径大小和电荷性质，可以实现对不同分子量蛋白质的有效分离。

在研究酶活性和蛋白质相互作用等方面有着广泛的应用前景。

非变性凝胶电泳

非变性凝胶电泳非变性凝胶电泳(NCGE)是一种用于定量分析的新技术，它以变性聚丙烯酰胺凝胶为支持物，在支持物两侧的电场作用下，电泳后的胶片不经变性，可在室温下长期保存。

电泳结果与琼脂糖凝胶电泳相比，其灵敏度大大提高，分辨率也较好，尤其对低浓度样品分析很有价值，同时样品的回收率也很高。

变性凝胶电泳具有的这些特点使得它在环境科学、生命科学等领域里得到了广泛的应用，并且已逐渐取代琼脂糖凝胶电泳成为常规方法。

NCGE以其独特的优点吸引了众多专家和学者，但是随着对NCGE方法认识的加深，人们发现NCGE技术仍然存在许多尚未解决的问题，其中包括电泳后的凝胶如何保存和应用。

非变性凝胶电泳技术可望解决上述问题，所以具有广阔的应用前景。

由于NCGE技术在环境监测方面有巨大潜力，所以，近年来已成为国际环境科学研究中的热点。

本课题的研究内容及拟解决的关键问题是：电泳后的凝胶如何保存和应用。

通过对保存条件、方法的探讨，我们得出以下结论：(1)选择合适的保存条件可以保证电泳凝胶的稳定性。

(2)溶液的pH对电泳凝胶的质量有很大影响， pH值大于4时，将增大蛋白质分子的电荷密度，而降低电泳凝胶的电泳效果。

(3)电泳凝胶的质量受其中含有蛋白质的种类、数量、电泳速度等因素的影响。

电泳速度过慢，则凝胶质量难以保证。

(4)在室温下保存电泳凝胶，其活性、活力随时间的延长而下降。

因此，实验表明，电泳凝胶在未经任何保护措施的情况下放置4个月后，电泳效果几乎丧失，并开始降解，所以保存电泳凝胶必须在低温下进行。

另外，对样品分析的影响： NCGE虽然具有灵敏度高，分辨率好的优点，但是它对样品的回收率较低，样品处理和预处理也较繁琐。

变性凝胶电泳虽然操作简单，但是费时费力，并且一次只能分析少量的样品，所以将变性凝胶电泳技术与NCGE技术结合起来使用，可以减少处理样品的繁琐程序，又可以在保证分析精度的前提下，大大提高分析效率，并且还可以回收更多的试剂，对提高分析结果的精确度和可靠性有重要意义。

利用非变性凝胶电泳分析蛋白质寡聚体

利用非变性凝胶电泳分析蛋白质寡聚体一.目的1.掌握非变性凝胶电泳的基本原理和操作方法2.学习利用非变性凝胶电泳来分离猪脑微管蛋白样品二.实验原理带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极移动的，这种现象称为电泳(electrophoresis)。

在一定pH条件下，每一分子都具有特殊的电荷（种类与数量）、大小和形状，因此在一定的时间内它在相同的电场中便应该集中到特有的位置上而形成紧密的泳动带。

这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本原理。

一般可以把电泳分成三类：自由界面电泳、区带电泳和稳态电泳。

•自由界面电泳：胶体溶液与溶剂间形成界面的电泳行为。

•区带电泳：胶体在各种不同的惰性支持物中进行电泳，不同组分形成带状区间。

•稳态电泳：分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到一个稳态，带的宽度不随时间而变化。

分析蛋白质样品时，最常用的是以聚丙烯酰胺凝胶为介质的区带电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的三维网状结构。

聚丙烯酰胺凝胶机械性能好，有弹性，透明，化学上稳定，对pH和温度比较稳定，属于非离子型的，没有吸附和电渗作用，特别适合作为区带电泳的支持介质。

而且，凝胶的孔径大小可以通过改变浓度和交联度来控制。

凝胶浓度是指每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%表示。

交联度是指凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分数，用T%表示。

改变凝胶浓度和交联度，可以获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应不同样品的分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是依据两种特殊的效应，即“电荷效应”和“分子筛效应”。

电荷效应是指每一种生物大分子在一定pH条件下都带有一定量的某种电荷，在电场中可以向与其自身带相反电荷的电极移动，移动的速度与其所带的电荷量成正比。

《RNA实验技术》03 RNA琼脂糖凝胶电泳

（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。

在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测
试剂：
（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。

（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。

（3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。

v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。

操作：
（1）将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

（2）配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。

②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。

③灌制琼脂糖凝胶。

（3）样品准备：
①取DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂：10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品4.5ul,混匀。

②将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。

③向管中加入3ul 上样染料，混匀。

（4）上样。

（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。

（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶制备4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，溶液 120ml 240ml40%Acr 24ml 48ml2%Bis 12.84ml 25.68ml10XTBE(8.3) 12ml 24mlddH2O 70.8ml 141.6ml针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下：胶混合液10%APS TEMED一板胶30ml 180μL 80μL两板胶60ml 360μL 160μL制胶及电泳（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。

1 用1～2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。

RNA琼脂糖凝胶电泳

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤来源：生物谷访问量：71评论（0）分享一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。

非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。

只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。

因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。

在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。

琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。

四、实验步骤（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。

在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。

在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂：（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。

（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。

（3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。

v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。

操作：（1）将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

（2）配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。