最新省时6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验试剂及配制:
a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。
丙烯酰胺38 g,甲叉双丙烯酰胺 2 g,加双蒸水定容至 100mL,过滤,贮存于棕色瓶中。
b,变性剂。
1 M NaOH 1 mL,甲酰胺 95 mL,溴酚蓝 0. 05 g,二甲苯青 0. 05 g,加双蒸水定容至100 mL。
C, 固定液。
100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。
d, 银染液。
硝酸银 1 g, 37 甲醛 1. 5 mL,加双蒸水定容至1000 mL。
f, 显影液。
无水碳酸钠 30 g, 37 甲醛 1. 5mL, 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL,加双蒸水定容至 1 000 mL。
DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程
6 %变性凝胶的制备:40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL,尿素36.36g, 5 × TBE 15mL,加双蒸水定容至 75 mL。
预冷至 4 ℃后,加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀,灌胶。
灌胶完毕,插入样品梳,在室温下聚合 30 ~60 min。
聚合完全后,梳齿下可见二条折光线。
电泳:安装电泳装置,在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液,使缓冲液覆盖样品孔。
拔出样品梳,用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。
打开变压器,恒定功率 60 W 预电泳 15 ~30 min。
预电泳结束后,用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ~ 5 μL) ,电泳直至带型分开。
固定:关闭电源,卸下玻璃板,剥离玻璃板,将胶板置于固定液中固定 30 min,直到指示剂颜色褪去。
漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍,
每次 2 ~ 3 min。
染色:转移胶板至染色液中,在摇床上摇
动染色 30 ~ 40 min。
显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ~ 10 s 后
立即放入预冷为 4 ℃~ 10 ℃的显影液中,摇动显
影直到带型完全出现。
定影:将出现带型的胶板放入固定液中定
影 2 ~ 3 min,再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。
干胶:胶板置于室温自然干燥。
带型统计
改良方法:a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO
b,漂洗蒸馏水2-3s
C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min
d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。