最新省时6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验试剂及配制：

a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。

b,变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。

C, 固定液。100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。

d, 银染液。硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。

f, 显影液。无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。

DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程

6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。

电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。

固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。

漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍，

每次 2 ～ 3 min。

染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇

动染色 30 ～ 40 min。

显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后

立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显

影直到带型完全出现。

定影:将出现带型的胶板放入固定液中定

影 2 ～ 3 min，再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。

干胶:胶板置于室温自然干燥。

带型统计

改良方法：a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO

b,漂洗蒸馏水2-3s

C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min

d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。