DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理,步骤和结果分析
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理，步骤
和结果分析
一、实验原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理基于蛋白质在凝胶电泳过程中受到凝胶孔隙大小及电场力的影响而发生迁移分离。
在非变性条件下，蛋白质保持其原有的构象，通过电泳进行分离。
二、实验步骤
1. 制备凝胶：首先准备非变性聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过聚丙烯酰胺单体聚合成凝胶板。
2. 样品加载：将待分离的蛋白样品混合添加载体缓冲液，并加热变性处理，然后加载到凝胶槽中。
3. 电泳分离：将已加载样品的凝胶槽浸入电泳缓冲液中，施加电场进行电泳分离，蛋白质根据其分子大小及电荷迁移至不同的位置，最终形成条带。
4. 凝胶染色：分离完成后，应用染色方法将蛋白质条带可视化。
5. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移位置以及染色效果，分析样品中含有的蛋白种类及相对含量。
三、实验结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们可以获得样品中蛋白质的分子量信息，并进一步分析样品中可能存在的杂质及纯度。
在电泳过程中，蛋白质根据其分子大小在凝胶中迁移的速度不同，从而实现了蛋白质的分离。
根据蛋白质在凝胶上的位置，我们可以对样品进行定性和定量分析，从而获得关于样品组成和含量的重要信息。
综上所述，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单有效的蛋白质分离技术，广泛应用于生物学和生物化学研究中。
通过实验结果的分析和解读，可以更好地了解样品中蛋白质的组成及结构，为进一步的实验研究提供重要参考。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方PAGE步骤1、清洗：1）戴上胶手套，将事先用NaOH溶液浸泡2—4h后的亲水板取出，用热水及洗涤剂刷洗需要使用的一面。
用试管刷轻刷，一般洗三次左右，直至干净，洗净后，置于通风橱风干。
取疏水板洗净后，置于通风橱风干。
（注意：洗的时候亲水板和疏水板要分开，所用刷子也要分开。
）2）用无尘纸沾取少量无水乙醇，擦净亲水版和疏水板，分别2次，风干。
2、硅化：倒亲水硅烷与亲水版上，轻涂，使其均匀涂抹（可先画圈然后上下刮擦），倒疏水硅烷与疏水板上，轻涂，使其均匀涂抹。
将两板置于通风橱中硅化15min以上。
3、装板：将疏水板置于下方，两边置隔离带，亲水版扣上，使端部齐平，立放；卡好两边卡子，固定好，取底座，上好板子，旋紧，平放。
手动调节水平。
4、制胶：1）准备好梳子、针筒、枪和枪头，在量筒中加入适量PAG，加入适量TEMED和APS。
立即混匀，迅速吸入针筒，注射器垂直注入胶板，倒插梳子，排除气泡，等待其凝固，大约需时20—30min。
（期间可向PCR产物中加入SGB）2）取出倒插的梳子，刮去废胶，用热水冲洗，前后上好电泳槽。
3）1×TBE缓冲液于电泳槽中预热半个小时，排除气泡。
插梳子，点样3.5ul。
5、电泳：45℃,75W，1h左右。
电泳完后取板，取胶，取梳子。
6、染色：1）固定：3L蒸馏水，20ml冰乙酸，400ml乙醇，在摇床上震荡5min。
2）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。
3）染色：2L蒸馏水，5gAgNO3(可反复利用)，在摇床上震荡12min。
4）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。
5）显色：2L蒸馏水，60gNaOH，8ml甲醛，在摇床上震荡直至显色，但是显色时间最好在15min以内。
6）用弱水冲洗3—5min，晾干观察，最后统计记录。
6﹪ PAGESGB 10ml (棕色瓶存放)去离子甲酰胺10ml二甲苯氰（FF）10mg溴酚蓝（含蔗糖）10mgEDTA（0.5mol/L，PH=8.0）200ulAPS(2.5﹪)2.5gAPS(过硫酸铵)，100ml水（一周之内用完）亲水硅烷（100ml 0.5﹪Bind-Silane）500ul Bind-Silane+500ul冰乙酸+99.5ml无水乙醇剥离硅烷（50ml 2﹪Repel-Silane）49ml氯仿+1mlRepel-Silane,混合后室温保存PAGE上样Loading Buffer(3×SGB)98﹪甲酰胺、0.025﹪二甲苯氰、0.025﹪溴酚蓝、10mmoL/L EDTA0.5mol/L EDTA29.225gEDTA溶于200mlddH2O中。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨_李其松
H e ilong jiang A ni m a l Sc ience an d V e te r in a ry M ed ic in e
10 2006
要远, 同样有利于基因型的判断。 目前 , 许多实验室 PCR 扩增的片段主要采用琼 脂糖电泳、 EB 染色。在琼脂糖中用 EB 染色可检测 出少于 10 ng 的 DNA, 但琼脂糖电泳的分辨率较低 , 对有些试验不太适用。聚丙烯酰胺的分离效果较好 , 但如果用 EB 染色 , 聚丙烯酰胺淬灭 EB 的 荧光, 使 EB 染色的 灵敏 度降 低, 不能 检测 出少 于 10 ng 的 DNA。另外, EB 染色容易产生污染。用 EB 染色后 , 只能用照片记录试验结果, 而不能把试验结果及时保 存下来为以后的试验做参考和指导。试验采取了银 染的方法 , 同时在试验中我们将染色 的方法作了改 进。这种方法可提 高灵敏度 5 ~ 10 倍 , 而且避免了 EB 的污染及紫外光对人眼睛和皮肤的损伤 , 并缩短 了银染的时间。同时改进的染色方法与其他方法相 比具有操作时间短、 背景颜色浅、 操作程序简单、 灵敏 度高、 染色液容易保存等优点。 高浓度、 高交联度的凝胶中不同的 DNA 分子条 带更易分开, 条带清晰, 利于判型; 低浓度、 低交联度 的凝胶中 , 同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离 更远, 同样利于不同基因型的判断, 每位试验者应该 根据自己的试验适时调整试验方法, 同时选择简单方 便的染色方法 , 可以收到事半功倍的效果。 ( 009)
收稿日期 : 2005 09 19 作者简介 : 李其松 ( 1981 ) , 男 , 硕士研究生 . 通讯作者 : 王金玉 ( 1952 ) , 男 , 教授 , 硕士 , 博士生导师 .
图 3 14% 的胶
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。
在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。
然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。
随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。
蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。
这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。
1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。
是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。
这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。
Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。
在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。
但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。
并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。
1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染) V1.0
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
DNA的银染
（下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜）
电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘（ 不要碰凝胶表面！）
用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板 去水后，用10%乙醇进行凝胶固定 10 min，轻摇 去乙醇，水洗、加入1%硝酸，轻摇5min 吸出硝酸，用蒸馏水漂洗2次
加入0.2%硝酸银溶液，轻摇20min 蒸馏水漂洗3次 去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色 观察区带出现，效果最佳时移除显色液 加入3%乙酸，轻摇5min 移除3%的乙酸溶液，10%乙醇洗涤1次 观察结果
聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染
原理
在弱酸环境下银离子可以与DNA结合，碱性甲
醛溶液可以将结合的银离子还原成金属银，显影成
DNA非变性PAGE胶 试剂及其功能：
10%乙醇 1%硝酸 0.2%硝酸银 显色液（3% Na2CO3，1%甲醛，新鲜配制）
3%乙酸
实验操作及注意事项
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验修改版
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液：1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）4、TEMED5、20-200 DNA marker实验步骤：1、配置10%的胶10ml：5.5 ml water3.3ml 30% Acrylamide1ml 10 ×TBE0.11ml APS（现配现用）0.01mlTEMED2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。
3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。
4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。
二银染实验银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加0.15ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将6g Na2CO3溶解于200ml ddH2O中，冷却至4℃，使用前加0.3ml37%甲醛溶液（通风厨中进行）30μl0.1M五水硫代硫酸钠；（0.1M Na2S2O3。
5H2O：将1.24g Na2S2O3。
5H2O溶于50ml ddH2O）。
放入冰箱中冷却到4摄氏度。
注意事项：1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；8、显色过程中盘中须轻轻摇动。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛0.5ml，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（详细参考）
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（详细参考）Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。
Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μMDNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。
1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4. 取上清到新的EP管中。
在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；6. 重复4、5步直到上清澄清；7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。
原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。
）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。
）13. 在管中加入16μL 1*TE溶液；14. 进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤(总2页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤一、制胶前的准备1、玻璃板的准备用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将1mm塑料薄片沾少许清水，使其贴在玻璃板上，然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。
2、垂直平板支架的安装将准备好的玻璃板，放入垂直支架内，两侧用钢夹使其固定，钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜，两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。
3、玻璃板的密封将1%琼脂糖用微波炉加热融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量琼脂溶液，沿玻璃板两边的缝隙内加入，使其密封，待其冷却凝固后备用。
二、凝胶的制备1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）配方：丙烯酰胺（Acr）290g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）10g步骤：称取样品，倒入烧杯中用蒸馏水定容至1 L将烧杯置于搅拌器上，使溶液充分溶解至透明将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用2、10ｘTBE溶液的配制（1L）配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：步骤：称取各成分至烧杯用蒸馏水定容至1L用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解分瓶倒装待用3、PAGE凝胶的制备（一块胶为例）配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵（AP）200ul;TEMED溶液20ul步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶4、灌胶把垂直支架倾斜30°，将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，倒入过程中要避免气泡的产生，发现有气泡产生时，要待气泡消失后再倒入。
灌胶完成后，用枪吸取少量水密封胶口，压平胶面。
当胶面与水之间有一条明显的界限时，表示凝胶已凝固，可以开始点样电泳。
三、点样及电泳1、ｘTBE缓冲溶液的配制量取950ml的蒸馏水，然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处，装瓶摇匀，备用。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶制备4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，溶液 120ml 240ml40%Acr 24ml 48ml2%Bis 12.84ml 25.68ml10XTBE(8.3) 12ml 24mlddH2O 70.8ml 141.6ml针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下：胶混合液10%APS TEMED一板胶30ml 180μL 80μL两板胶60ml 360μL 160μL制胶及电泳（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。
1 用1～2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验试剂和操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验试剂和操作步骤实验试剂：试剂贮备液：1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。
4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。
5、核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。
6、蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。
7、电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。
8、过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。
9、溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。
10、脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。
11、蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20m l，蒸馏水80ml，溶解后混合之。
12、过氧化物酶染色液：1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。
抗坏血酸70.4 mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水 72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。
2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。
0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。
30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。
邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。
用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
实验步骤：凝胶的制备：1、清洗干净两块玻璃板，晾干后按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开， 反之亦然;
4.变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。上样buffer中没有SDS之外，加入样品后不能加热。
结果与分析
结果与分析
记录和观察电泳过程中的温度变化，电泳完后进行活性染色时凝胶有色条带的变化。对比活性染色和常规的 考马斯亮蓝染色后凝胶中蛋白质条带的变化。
注意事项
注意事项
1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量 以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系 统；
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
01 实验原理
03 实验步骤 05 注意事项
目录
02 实验器材与试剂 04 结果与分析
基本பைடு நூலகம்息
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对 保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。
实验原理
实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS和巯基乙醇 等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。未加 SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其 电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶 等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电 泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以 分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
聚丙烯酰胺凝胶配制方法
5×TBE（组份浓度：5×TBE，pH 8.3；配制量：1 L）：称取53.9 g Tris，27.5 g硼酸，量取20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），置于1 L烧杯中；加入约800 ml 超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。
10% 过硫酸铵（组份浓度：10% (W/V) 过硫酸铵；配制量：10 ml）：称取1 g过硫酸铵，置于10～50 ml烧杯中；加入约8 ml超纯水，搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至10 ml；4 ℃保存（保存时间为2周左右，超过期限过硫酸铵将失去催化作用）。
30% 丙烯酰胺（组份浓度：30% (W/V)丙烯酰胺；配制量：1 L）：称取290 g 丙烯酰胺，10 g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，置于1 L烧杯中；加入约600 ml超纯水，水浴加热至37 ℃，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1 L，用0.45 μm滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液pH值应不大于7；棕色瓶4 ℃保存。
0.1% AgNO3（组份浓度：0.1% (W/V) AgNO3；配制量：1 L）：称取1 g AgNO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，；加超纯水将溶液定容至1 L；棕色瓶室温保存。
显色液（组份浓度：2% (W/V) NaOH，0.04% (W/V) Na2CO3，0.4% (W/V) 37%甲醛；配制量：1 L）：称取20 g NaOH，0.4 g Na2CO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，充分搅拌溶解；加4 ml 37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。
10% 冰乙酸（组份浓度：10% 冰乙酸；配制量：1 L）：量取100 ml冰乙酸，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，搅拌混匀；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。
2.2.6 电泳检测2.2.6.1 玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗；然后用Ⅲ级蒸馏水漂洗2～3次，直至玻璃板表面出现均匀水膜，既不聚成水滴，也不成股流下；再用超纯水漂洗1次，晾干；最后用无水乙醇擦拭，晾干备用[74]。
实验十SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色法）
实验十 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色法）实验目的1.通过实验了解蛋白质凝胶电泳银染色法的原理。
2.进一步熟悉SDS—PAGE操作，掌握银染色法的实验技术。
实验原理自1979年，Switzer等人提出银染色法后，又经许多学者不断改进，实验表明银染色法较考马斯亮蓝R250灵敏100倍，但染色原理尚不十分清楚，可能与摄影过程中Ag+的还原相似，也可能它对蛋白质分子中氨基酸具有较高的亲和力，从而使蛋白质染成黑色谱带。
试剂与器材(一)、试剂1.牛血清白蛋白（经微量凯氏定氮法测定蛋白含量）溶液准确称量牛血清白蛋白0.5mg，溶于连续系统SDS—PAGE样品溶解液2.5ml中。
2.0.05%考马斯亮蓝R250染色液内含20%磺基水杨酸3.固定液20%三氯乙酸及1%戊二醛各200ml。
4.氨银染色液此液应临用前配制，取0.1mol/LNaOH 20ml、浓氨水 1.4ml，混合摇匀得混合液，取4ml19.4%硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动器皿，全部滴完后用重蒸馏水定容到200ml。
5.显色液此液应临用前配制，取40%甲醛50µL和1%柠檬酸0.5ml，混匀后加重蒸馏水定容至250ml。
6.脱色液(1).称NaCl 37g，CuSO4·H2O 37g,加重蒸馏水850ml,滴加浓氨水至溶液呈澄清的深蓝色,定容至1000ml.(2).称硫代硫酸钠21.8g,加重蒸馏水至100ml,4℃贮存.使用前将(1)和(2)等量混合后稀释30倍.(二)、器材夹心式垂直板电泳槽[凝胶模(135×100×1.0mm)],直流稳压电泳仪(300—600V，50—100 mA)，微量注射器，大培养皿（Φ18cm）。
操作方法(一)仪器安装配制连续SDS—PAGE 10%PAA，制胶后，加入含0.1%SDS的PH7.2 0.1mol/L磷酸盐电极缓冲液。
(二)加样加样量分别为2.5µl，5µl，8µl，10µl。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
1.清洗电泳仪和电泳板。
2.准备实验用液，将需要的磷酸缓冲液和聚丙烯酰胺溶液以及添加的阳离子
表面活性剂混合均匀。
3.调节电泳仪的温度、电压、时间等参数。
4.垂直安装电泳板，将电泳板安装在电泳支架中，保证其处于垂直位置。
5.将溶液添加到电泳板，并将电泳板放入电泳仪中进行实验，注意实验过程
中溶液的变化，以便及时调节电泳仪参数。
6.实验完毕后取出电泳板，用纸巾擦拭干净，重复上述实验步骤，直至所有
实验完毕。
7.染色及脱色，电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染
色1小时以上。
染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。
置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。
此时改用7%醋酸充装在液槽中。
通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。
在我们的试验中省略的染料泳向正极。
脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。
3-4小时脱色完毕。
有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶电泳法被广泛应用于生物学研究中，通过该方法可以对DNA、RNA和蛋白质分子进行分离、检测和纯化。
首先，我们需要准备电泳仪、聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液和样品。
其中，缓冲液的配制非常重要，通常使用的是三种缓冲液：电泳缓冲液、样品加载缓冲液和电解质添加缓冲液。
合理的缓冲液配制可以保证电泳过程的稳定性和分离效果。
其次，我们需要将聚丙烯酰胺凝胶浸泡在电泳缓冲液中，然后在电泳仪中将凝胶固定在样品槽上。
接着，我们将样品与样品加载缓冲液混合后滴到凝胶孔上，并在电泳过程中施加电场。
在电泳过程中，DNA、RNA和蛋白质分子会向正极或负极迁移，其迁移速率和分离程度取决于分子大小、电荷和凝胶孔的孔径大小。
在一定时间后，我们可以取出凝胶进行染色或蛋白质Western blot检测等进一步分析。
总的来说，聚丙烯酰胺凝胶电泳法具有操作简便、灵敏度高、分离效果好等优点，广泛应用于生物学、医学、农业和环保等领域。
但需要注意的是，该方法存在缺陷，例如无法分离过大或过小的分子，对于某些样品需要面临困难，最好结合其他方法一同使用，以得到更加准确的结果。
BIO-RAD 聚丙烯酰胺凝胶银染方法
聚丙烯酰胺凝胶银染方法
（2块8*10cm厚0.75-1.0cm的小胶）
1、固定——20min
(1)固定液的准备：
(2)取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，放入固定液中，置于摇床上，轻轻震荡20min。
注意：固定时间参照表1.
2、漂洗——20min
弃去固定液，加入400ml的去离子双蒸水，置于摇床上，震荡10min。
重复1次。
对于更大更厚的胶，用800ml的水漂洗。
3、染色——20min
染液的准备：（使用前5min之内准备）
35ml去离子水于一锥形瓶中
5.0ml Silver Complex Solution
5.0ml Reduction Moderator Solution
5.0ml Image Development Reagent
使用前快速加入50ml的室温的Development Accelerator Solution，充分混匀，倒入染色槽中，轻轻振荡，直至蛋白质条带具有足够的显色强度。
约15min。
4、终止——15min
准备5%的乙酸溶液。
将胶放入终止溶液中,置于摇床上，振荡15min，然后用超纯水中漂洗5min。
表1。
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D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及
步骤
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DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：
1、30％聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺
过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED
4、5xTBE
Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂
1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：
30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：
1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！
聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。
同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。
银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。
需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。
下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验
测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。
因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。
在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。
保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。
从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。
注重，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。
浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。
若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 马上将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。
停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。
在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
经验分享：
（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10％的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。
可提前配制，室温放置。
（2）染色液：我们用的是％的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。
硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。
（3）显影液：用10％碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。
这一步很重要，假如没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。
因此在固定前就要把显影液配好。
（4）在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制，这一步要在显影前加，不要提前加。
原理忘记了，但是一般都是这样做的。
甲醛将银离子还原为金属银，硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。
甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的，根据凝胶染色的效果决定。
当时我是把甲醛调整为，硫代硫酸钠改为420μl，两者作用不一样，所以调整的时候一个多，一个少，而且要微调。
具体什么方向调整忘记了，需要摸索最合适的条件。
（5）也是比较重要的，即一定要分两次显色，第一次显色出现条带后马上转移至剩下的显影液中。
显色时间第一次大概是5分钟左右，操作中一定要在边上看着。
显色后马上放入终止液（10％的冰乙酸）中，两分钟后放入纯水中即可，两分中后取出即可。
（6）对我来说教训最为惨痛的，即显色时间的控制。
第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止，因为显色有一个延续效应。
当时我染色时，忽然走神了，就走神5秒钟，胶全黄了，背景奇高。
我两天的工作因为5秒钟全部over了，当时差点疯了。
我的经验是：当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止，具体时间需要摸索，但一定要提前终止。
再加一句：万一染色浅了是可以复染的，效果差不太多。
十分感谢!顶下,不错求助：DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤aifuhong 你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗aifuhong你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗。