聚丙烯酰胺凝胶

电泳的迁移率
取决于核酸分子本身的大小和构型
分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子
迁移率要快；
同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的
比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率
要快。
凝胶电泳的分辨力 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间；
Separation Range of Agarose
PolyAcrylamide Gels (PAGE)
2 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖： 一种从红色海藻中提取出的线性多糖 聚合物。 分为
常熔点的琼脂糖
低熔点（LMP）琼脂糖
Agarose gel electrophoresis
LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min
方法：利用已知大小的DNA片段作标准(marker /ladder),目的DNA片段与之比对、估计。 例如：HindⅢ将λ DNA切成8个片段，这些片段的 大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中 的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位 置而加以估计。 尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5％的错 误率
4 通过凝胶电泳分离染色体

传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的， DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子 在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而 被分离开。
只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离， 因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越 小。 实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于 50kb的DNA分子。
第一章 基因操作的主要技术原理
第二节 凝胶电泳
1 凝胶电泳Байду номын сангаас
凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分 子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的 重要实验手段，同时也是分子生物学研 究方法的技术基础。
凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这 些孔道才能够到达阳极。
小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。
凝胶电泳的种类
凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNA大小 琼脂糖凝胶： 相对大的孔道，分离大一些的分子； 聚丙烯酰胺凝胶： 很小的孔道，分离小的DNA分子， 能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNA分子。
用途
琼脂糖凝胶： 用于DNA和RNA的常规分析 聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析 凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察
染色和观察： 溴化乙锭（EB）染色， 在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪） 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
DNA分子大小的估计
如何确定凝胶电泳中片段的大小? 最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学 关系。相关公式是： D=a-b (logM) D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖 于电泳条件的常数。 通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA 片段大小的方法。
按凝胶材料分:
聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶
竖式/聚丙烯酰胺凝胶
两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易
2 核酸电泳 基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚 丙烯酰胺凝胶）和缓冲液， 在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以 及所带电荷的不同， 可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。


脉冲电场凝胶电泳（PFGE）
1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的 DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉 冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个 脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃ 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电 流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就 使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适 应凝胶孔隙的无规则变化。
对放射性标记的DNA进行放射性自显影
染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带 中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后 仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加 灵敏的检测手段。 放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏 感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA 分子。 放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。
Sample Well
25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose
kb
12 10 8 6 4
Agarose Gel Electrophoresis
EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA
2
1
根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小
Agarose gel electrophoresis
3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1） TEMED 过硫酸铵（10％） 缓冲液：TBE
链分离凝胶-SSCP
用于单链分离,可以进行SNP的检测。 PAGE 原理： SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 加热后解链后电泳，迁移速度不同。
核酸测序凝胶
可以分离1bp的差异 用途：测序、AFLP、 为避免局部区域产生二级结构，可采用各 种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度， 凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）
回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液；
琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE, TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间， 小片段高电压短时间
使凝胶中的DNA分子可视化
染色是最简单的方法。 溴乙锭(EtBr) 能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶 中的DNA进行染色。 只要在足够的DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在 紫外照射下能以不同的条带显示出来。 注意： 溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。 因此，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照 射就能看见DNA的非致癌染料，越来越多地被用于 实验室研究中。