聚丙烯酰胺凝胶电泳

• 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 （acrylamide, Acr）和交联剂甲叉双丙烯 酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis） 在加速剂（TEMED）和催化剂（硫酸铵） 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶
聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶
• 特点：(1)在一定浓度时，凝胶透明、有弹 性、机械性能好 (2)化学性能稳定，与被分 离物不起化学反应 (3)对pH和温度变化较 稳定 (4)几乎无电渗作用 ,只要Acr纯度高， 操作条件一致，则重复性好 (5)样品不易扩 散且用量少 (6)凝胶孔径可调节 (7)分辨率 高
分子量范围与凝胶浓度的关系
PAGE的分类
• 根据具体操作分为：圆柱型，平板型（水 平方向、垂直方向） • 根据凝胶系统的均匀性分为：连续系统， 不连续系统
PAGE圆盘电泳示意图
不连续圆盘电泳示意图
不连续电泳的物理效应
• 样品浓缩效应：凝胶孔径不连续 缓冲液离子成分不连续 pH的不连续性 • 分子筛效应 • 电荷效应 各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小 和形状不同而得以分离
等电聚焦电泳
（isoelectric focusing electrophoresis, IEFE）
• 利用具有线性pH梯度的电泳介质来分离等 电点不同的蛋白质 • 当蛋白质迁移至其pI相同的pH处，则不再 泳动，而浓缩成狭窄的区带 • 蛋白质因其等电点的不同而得以分离
pH梯度的形成
IEFE的聚焦效应
常规PAGE与SDS-PAGE的区别
IEFE优缺点
• 优点:(1)分辨率高,可将pI相差0.01～ 0.02pH单位的蛋白质分开 (2)区带狭窄 (3) 样品不管加到什么部位都可聚焦到其等电 点 • 缺点:(1)需用无盐溶液，而无盐溶液中蛋白 质易沉淀 (2)不适于在pI点不溶解或发生变 性的蛋白质
SDS-蛋白质复合物的形状
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖 • 优点：(1)含液体量大，达98％～99％，近 似自由电泳，但样品扩散速度小，对蛋白 质吸附极少 (2)分辨率高,重复性好 (3)电泳 速度快 (4)透明,不吸收紫外线，可直接用紫 外检测仪测定 (5)区带可染色，样品易回收 • 缺点：含有较多硫酸根，电渗作用大 • 用途：用于核酸的分离、鉴定
电泳技术 （electrophoresis）
本章主要内容
• • • • • • • 基本原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS-PAGE电泳 琼脂糖凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳
概
念
• 带电粒子在直流电场中的作用下，在一定 介质（溶剂）中发生的向异性电极定向移 动的现象称为“电泳” • 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技 术称为“电泳技术”
PAGE常见问题
• 凝胶不聚合或聚合时间过长：最常见原因 是硫酸铵失效，需新鲜配制；室温较低时 聚合变慢，可调整硫酸铵和TEMED用量 • 指示剂向相反方向移动:电源连接错误，缓 冲液选择错误 • 指示剂前沿呈“曲线”：“微笑”现象由 凝胶冷却不均匀造成；“皱眉”现象多由 电泳装置不合适、底部气泡或靠近玻片的 凝胶聚合不完全引起
SDS-PAGE
• SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate），阴离子去垢剂 • SDS带有大量负电荷，大大超过天然蛋白 质原有的电荷量，从而消除或掩盖了不同 种类蛋白质间的电荷差异 • SDS作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内 和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋 白质分子的二级和三级结构 • SDS-蛋白质的迁移率取决于分子量的大小
凝胶聚合的影响因素
• 空气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止， 故聚合过程中反应液应与空气隔绝 • 某些材料如有机玻璃等能抑制聚合反应 • 某些化学药物如赤血盐等可减慢反应速度 • 温度升高聚合加快，温度降低聚合减慢
聚丙烯酰胺凝胶的性质
• 总浓度T%：100ml凝胶中含有Acr和Bis的总克数 • T％越大，平均孔径越小，凝胶机械强度增加。 但达15％时胶脆性增大，易断裂；T％过小则凝 胶稀软不易操作 • 交联度C%：交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百 分数 • T%值固定时，C％＝5％时孔径最小，高于或低 于5％时孔径相应变大。C%过大胶不透明，缺乏 弹性；过小则凝胶呈糊状
影响电泳的因素
• 样品的性质 • 电场强度 • 缓冲液： (1)pH值 (2) 成分 (3)离子强度 • 支持介质：吸附、电渗，分子筛 • 温度
电
渗
（electro-osmosis）
• 在电场作用下液体相对于固体表面的移 动称“电渗”
醋酸纤维薄膜电泳
（cellulose acetate membrane electrophoresis, CAME）
• 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的 纤维素醋酸酯 • 对蛋白质样本吸附少，分离速度快，时间 短，电渗作用虽然高但很均一，不影响分 离效果，经透明化处理后有利于光吸收扫 描测定和膜的长期保存 • 影响因素：膜的性质，缓冲液，电流和电 压，电泳时间和温度，电泳槽的密封性能
聚丙烯酰胺凝胶电泳
（polyacryamide gel electrophoresis, PAGE）
分
类
Байду номын сангаас
• 按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳 （其中根据支持物的不同而有不同的名称 如纸电泳，琼脂糖电泳等） • 按电压分：低压电泳，高压电泳 • 按用途分：分析电泳，制备电泳，定量免 疫电泳 • 按支持物形状分：薄层电泳，平板电泳， 圆盘电泳，毛细管电泳 • 按区带形式分：盘状电泳，火箭电泳
特
点
• 凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离， 并可进行定性定量分析 • 样品用量少 • 设备简单 • 可在常温进行 • 操作简便省时 • 分辨率高
蛋白质电荷的来源
电泳的基本原理
• • • • 带电粒子在电场中所受的力F=QE 所受阻力F’=6πrηv 电泳平衡时F=F’，则QE= 6πrηv 迁移率(电泳淌度)＝Q/ 6πrη,表示粒子在单 位电场强度下的泳动速度 • 不同物质能否利用电泳进行分离，决定于 两者迁移率的差别，有差别才能分离。电 泳后分开的距离与迁移率、电压、时间等 相关