聚丙烯酰胺凝胶电泳(ppt)
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聚丙烯酰胺凝胶电 泳(ppt)
（优选）聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联 剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下 合成。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电 荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）
分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）
❖ 注意： ❖ 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚
合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致 孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）
（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（根据亚基分子量分离蛋白质）
（1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相 同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
2.凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度， 只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因 此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100%
当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
3、分类
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE
电荷效应 分子筛效应
PAGE
连续电泳 电泳体系中所用的缓冲液
成分、pH、凝胶浓度相同
不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶
浓度及电位梯度呈不连续性
电荷效应
分子筛效应
浓缩效应：不连续性所致
不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 分辨率高，是最常用的体系。
不连续SDS-PAGE 1.原理
凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性
浓缩胶 pH6.7
分离胶 pH8.9
① 凝胶的不连续性：
浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
❖ 注意： ❖ TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性
条件下聚合
❖ 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧， 隔绝氧
❖ 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
（2）光聚合：核黄素-TEMED系统
❖ 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外 光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有 氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素， 其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。
❖（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
PAGE 的 聚 合
❖ 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体 带有游离基，从而与Bis进行聚合。
❖ （1）化学聚合：AP-TEMED系统 ❖ 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium
persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺 （TEMED）为加速剂。 ❖ AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺， 然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 ❖TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
电泳缓冲液：Tris-甘氨酸
在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少， 在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者 之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者 之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带形 成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到 一起，浓缩为一狭窄的区带。
样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH 的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直 接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。
❖Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；
❖
＜10 很脆，易碎，不透明；
❖
＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T ——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100%
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。 ❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS
分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁 移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔 胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。
② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性
制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶 pH6.7 分离胶pH8.9
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wk.baidu.com
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SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚成组成它们的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的 蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷 达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同 分子之间原有的电荷差异。
蛋白质-SDS胶束的特点：
不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率 与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅 可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测 定蛋白质亚基的分子量。
PAGE的浓度与孔径的关系
❖ PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的 浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选 择合适的单体浓度。
（优选）聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联 剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下 合成。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电 荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）
分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）
❖ 注意： ❖ 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚
合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致 孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）
（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（根据亚基分子量分离蛋白质）
（1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相 同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
2.凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度， 只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因 此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100%
当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
3、分类
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE
电荷效应 分子筛效应
PAGE
连续电泳 电泳体系中所用的缓冲液
成分、pH、凝胶浓度相同
不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶
浓度及电位梯度呈不连续性
电荷效应
分子筛效应
浓缩效应：不连续性所致
不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 分辨率高，是最常用的体系。
不连续SDS-PAGE 1.原理
凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性
浓缩胶 pH6.7
分离胶 pH8.9
① 凝胶的不连续性：
浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
❖ 注意： ❖ TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性
条件下聚合
❖ 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧， 隔绝氧
❖ 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
（2）光聚合：核黄素-TEMED系统
❖ 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外 光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有 氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素， 其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。
❖（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
PAGE 的 聚 合
❖ 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体 带有游离基，从而与Bis进行聚合。
❖ （1）化学聚合：AP-TEMED系统 ❖ 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium
persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺 （TEMED）为加速剂。 ❖ AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺， 然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 ❖TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
电泳缓冲液：Tris-甘氨酸
在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少， 在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者 之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者 之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带形 成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到 一起，浓缩为一狭窄的区带。
样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH 的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直 接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。
❖Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；
❖
＜10 很脆，易碎，不透明；
❖
＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T ——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100%
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。 ❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS
分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁 移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔 胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。
② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性
制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶 pH6.7 分离胶pH8.9
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SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚成组成它们的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的 蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷 达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同 分子之间原有的电荷差异。
蛋白质-SDS胶束的特点：
不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率 与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅 可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测 定蛋白质亚基的分子量。
PAGE的浓度与孔径的关系
❖ PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的 浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选 择合适的单体浓度。