聚丙烯酰胺凝胶电泳(ppt)
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westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
《实验聚丙烯酰胺》PPT课件
6电泳
上槽——负极（黑） 下槽——
正极（红）
电流：先浓缩胶:1.5mA/管
然后分离
胶:3.0mA/管
7剥胶 电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为 润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓 旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可 用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出 玻管。
2制胶(取小烧杯2个,按表加液)
试剂
分离胶溶液 （ml）
分离胶缓冲溶液（ pH8.9）1.25
浓缩胶缓冲溶液（pH6.7） —
单体交联剂
2.5
DDW
6.19
催化剂（10%AP）
0.10
TEMED
0.02
成胶时间
30min
浓度
7.5%(孔小)
浓缩胶溶液 （ml） — 1.25 1.0 7.65 0.10 0.02 15min 3%（孔大）
3灌柱
按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管7cm 处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合2030min；
待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓 缩胶至7.5cm处，再滴加蒸馏水一滴，静置15min左右。
浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽吸去下层蔗糖 溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入 下槽缓冲液，排净管底空气使用。
分离机制： 1. 浓缩效应
➢凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径
➢缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)； 凝胶中 Cl-(快离子
Pr-介于二者之间
➢pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7； 分离胶pH冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-
上槽——负极（黑） 下槽——
正极（红）
电流：先浓缩胶:1.5mA/管
然后分离
胶:3.0mA/管
7剥胶 电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为 润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓 旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可 用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出 玻管。
2制胶(取小烧杯2个,按表加液)
试剂
分离胶溶液 （ml）
分离胶缓冲溶液（ pH8.9）1.25
浓缩胶缓冲溶液（pH6.7） —
单体交联剂
2.5
DDW
6.19
催化剂（10%AP）
0.10
TEMED
0.02
成胶时间
30min
浓度
7.5%(孔小)
浓缩胶溶液 （ml） — 1.25 1.0 7.65 0.10 0.02 15min 3%（孔大）
3灌柱
按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管7cm 处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合2030min；
待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓 缩胶至7.5cm处，再滴加蒸馏水一滴，静置15min左右。
浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽吸去下层蔗糖 溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入 下槽缓冲液，排净管底空气使用。
分离机制： 1. 浓缩效应
➢凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径
➢缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)； 凝胶中 Cl-(快离子
Pr-介于二者之间
➢pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7； 分离胶pH冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-
聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
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2.50 2.50 2.50 2.50
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1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
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1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
精选2021版课件
2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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27
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28
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29
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30
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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31
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32
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33
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
精选2021版课件
44
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
精选2021版课件
45
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
精选2021版课件
9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
《双向凝胶电泳 》课件
它结合了等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳的原理，能够分离出成千上 万的蛋白质。
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
常用的硅化剂为二氯二甲基硅烷 （dichlorodimethyl silane）,商品名为Siliconisel25。为了灌胶时不漏胶，可在封边条和玻璃板之 间涂医用凡士林，也有人用冷却至50℃的1%琼 脂糖凝胶封堵缝隙。或用胶带纸或医用橡皮膏将 玻璃板的三个边缘封贴。 三、制胶 根据所需的凝胶浓度配制凝胶溶液，参见表 4.7，灌胶前加入TEMED。
§4. 3. 2 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（continuous electrophoresis）是1959年L.Weintraub和 S.Raymond最早创立的，是指电泳系统采用相同孔 径的凝胶和相同的缓冲液（包括样品缓冲液、凝胶 缓冲液和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度不 同的条件下进行区带电泳。
C = 6.5－0.3T
（4.14）
此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C 值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围 约为 ±1％。
当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加 而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最 小。C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大 于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的 C是2.6％和3％。
该技术是利用样品（如蛋白质）的电荷效 应进行分离的，而凝胶的分子筛效应不明显。 一般只用于分离简单的样品，分辨率不高。 但由于其具有制胶简便、快捷、缓冲系统组 成简单、 pH 恒定等优点，至今还有部分实 验在使用该方法。
§4. 3. 3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（discontinuous electrophoresis，也称为圆盘电泳）是20世纪60 年代中期由S.Hjertè n、L.Orenstein和B. J. Davis 创建并完善的电泳技术。是指使用不同孔径的 凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳过程 中，凝胶按需要在一块玻璃板内被制成不同浓 度的两部分（小的部分是浓缩胶，大的部分是 分离胶）。
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不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率 与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅 可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测 定蛋白质亚基的分子量。
PAGE的浓度与孔径的关系
❖ PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的 浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选 择合适的单体浓度。
（1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相 同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
2.凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度， 只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因 此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。
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---ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚成组成它们的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的 蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷 达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同 分子之间原有的电荷差异。
蛋白质-SDS胶束的特点：
❖Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；
❖
＜10 很脆，易碎，不透明；
❖
＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T ——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100%
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
浓度及电位梯度呈不连续性
电荷效应
分子筛效应
浓缩效应：不连续性所致
不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 分辨率高，是最常用的体系。
不连续SDS-PAGE 1.原理
凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性
浓缩胶 pH6.7
分离胶 pH8.9
① 凝胶的不连续性：
浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁 移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔 胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。
② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性
制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶 pH6.7 分离胶pH8.9
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100%
当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
3、分类
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE
电荷效应 分子筛效应
PAGE
连续电泳 电泳体系中所用的缓冲液
成分、pH、凝胶浓度相同
不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶
❖（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
PAGE 的 聚 合
❖ 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体 带有游离基，从而与Bis进行聚合。
❖ （1）化学聚合：AP-TEMED系统 ❖ 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium
persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺 （TEMED）为加速剂。 ❖ AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺， 然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 ❖TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。
电泳缓冲液：Tris-甘氨酸
在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少， 在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者 之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者 之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带形 成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到 一起，浓缩为一狭窄的区带。
样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH 的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直 接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
❖ 注意： ❖ 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚
合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致 孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）
（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（根据亚基分子量分离蛋白质）
❖ 注意： ❖ TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性
条件下聚合
❖ 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧， 隔绝氧
❖ 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
（2）光聚合：核黄素-TEMED系统
❖ 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外 光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有 氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素， 其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。 ❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS
聚丙烯酰胺凝胶电 泳(ppt)
（优选）聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联 剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下 合成。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电 荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）
分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）
蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率 与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅 可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测 定蛋白质亚基的分子量。
PAGE的浓度与孔径的关系
❖ PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的 浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选 择合适的单体浓度。
（1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相 同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
2.凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度， 只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因 此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。
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---ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚成组成它们的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的 蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷 达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同 分子之间原有的电荷差异。
蛋白质-SDS胶束的特点：
❖Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；
❖
＜10 很脆，易碎，不透明；
❖
＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T ——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100%
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。
实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
浓度及电位梯度呈不连续性
电荷效应
分子筛效应
浓缩效应：不连续性所致
不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 分辨率高，是最常用的体系。
不连续SDS-PAGE 1.原理
凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性
浓缩胶 pH6.7
分离胶 pH8.9
① 凝胶的不连续性：
浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁 移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔 胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。
② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性
制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶 pH6.7 分离胶pH8.9
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100%
当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
3、分类
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE
电荷效应 分子筛效应
PAGE
连续电泳 电泳体系中所用的缓冲液
成分、pH、凝胶浓度相同
不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶
❖（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
PAGE 的 聚 合
❖ 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体 带有游离基，从而与Bis进行聚合。
❖ （1）化学聚合：AP-TEMED系统 ❖ 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium
persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺 （TEMED）为加速剂。 ❖ AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺， 然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 ❖TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。
电泳缓冲液：Tris-甘氨酸
在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少， 在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者 之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者 之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带形 成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到 一起，浓缩为一狭窄的区带。
样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH 的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直 接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
❖ 注意： ❖ 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚
合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致 孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）
（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（根据亚基分子量分离蛋白质）
❖ 注意： ❖ TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性
条件下聚合
❖ 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧， 隔绝氧
❖ 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
（2）光聚合：核黄素-TEMED系统
❖ 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外 光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有 氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素， 其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。 ❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS
聚丙烯酰胺凝胶电 泳(ppt)
（优选）聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联 剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下 合成。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电 荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）
分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）